Studio dell'efficacia dei tamponi di stoccaggio in fase commerciale e valutazione della variabilità del metaproteoma intestinale tra individui (PROTEGI)

A. Introduzione:

La metaproteomica studia l’intero complemento proteico di una comunità microbica e offre informazioni su ecosistemi complessi come il microbioma intestinale. La metaproteomica consente ai ricercatori di scavare in profondità nei microbiomi intestinali, fornendo informazioni sull'abbondanza e sulle attività funzionali di questi abitanti microbici. Questa conoscenza è stata determinante per chiarire i meccanismi alla base di varie malattie, come la malattia infiammatoria intestinale (Zhang et al., 2018) e l’obesità (Biemann et al., 2021). I ricercatori possono sviluppare strategie mirate per la medicina personalizzata e l’assistenza sanitaria di precisione basate sulla biologia sottostante (Nice, 2022) identificando le firme proteiche chiave.

Negli studi sul microbioma intestinale, la raccolta e la conservazione standardizzata dei campioni sono particolarmente cruciali per preservare l’integrità della comunità microbica e del suo proteoma. Infatti, per ottenere risultati affidabili è necessario considerare la suscettibilità alle influenze ambientali come la temperatura e la quantità di ossigeno. Per gli studi metaproteomici sul microbioma intestinale, si preferiscono metodi non invasivi o minimamente invasivi per ridurre al minimo l’interruzione o la contaminazione e preservare la composizione microbica nativa e i profili proteici. Inoltre, le strategie di manipolazione e conservazione dei campioni influenzano la degradazione delle proteine ​​e la stabilità della popolazione microbica. Per questo motivo, si consiglia spesso il congelamento immediato o la conservazione a basse temperature (ad esempio, -80°C) per mantenere l'integrità del campione fino all'analisi (Hickl et al., 2019). Tuttavia, l’utilizzo della catena del freddo per lo stoccaggio e il trasporto non è compatibile con una strategia di campionamento in loco necessaria per studi su larga scala e delocalizzati. Inoltre, è meno ideale, più costosa e logisticamente noiosa rispetto alle potenziali opzioni a temperatura ambiente.

Inoltre, la conoscenza attuale dei metodi di raccolta/conservazione dei campioni fecali si basa sulla conservazione degli acidi nucleici o dei metaboliti durante il trasporto al laboratorio per l'analisi. Tuttavia, la conservazione delle proteine ​​richiede strategie diverse e gli studi sono scarsi e si basano sull'adozione dei dispositivi o dei reagenti utilizzati nel caso dell'analisi degli acidi nucleici o dei metaboliti (Mordant & Kleiner, 2021). Pertanto, protocolli su misura e standardizzati insieme alla raccolta di metadati sono essenziali per garantire riproducibilità e comparabilità tra gli studi metaproteomici.

Il presente studio mira a valutare l’idoneità di diversi tamponi commerciali e non pericolosi per la conservazione nel tempo di campioni fecali dell’intestino umano. I campioni fecali verranno conservati in cinque diversi tamponi e verranno confrontati con campioni direttamente congelati. Utilizzando la metaproteomica confronteremo le identificazioni proteomiche, tassonomiche e funzionali per comprendere il potenziale di questi tamponi come soluzione di conservazione affidabile per le feci umane. Questa ricerca è unica e, per quanto ne sappiamo, nessuno studio simile ha affrontato questa domanda impegnativa.

Prove preliminari nell’uomo hanno mostrato variabilità inter e intra-individuale dei proteomi dell’ospite e dei microbiomi (Mehta et al., 2018). In particolare, la variazione tassonomica e funzionale intra-individuale nel microbioma intestinale sembra essere inferiore alla variazione inter-individuale nel tempo. Tuttavia, i profili metatrascrittomici hanno mostrato una variabilità paragonabile all’interno e tra i soggetti. Pertanto, utilizzando la metaproteomica, miriamo a valutare le variabilità inter e intra-individuali a livello del proteoma studiando campioni fecali raccolti periodicamente dai partecipanti.

B. La rilevanza accademica e sociale:

La prima parte dello studio mira a definire il tampone di stoccaggio più efficace per preservare l'integrità delle proteine ​​durante il trasporto del campione dal sito di raccolta al sito di elaborazione, un fattore chiave nel futuro della metaproteomica applicata alla salute e alla malattia. Nonostante la sua importanza, una valutazione simile non è stata eseguita per applicazioni proteomiche. Questa conoscenza sarà fondamentale per scopi accademici da utilizzare per studi di proteomica fecale umana su larga scala. Affinché le persone possano esaminare la loro salute intestinale attraverso la metaproteomica e sbloccare il potenziale della medicina personalizzata basata sulle comunità microbiche e degli interventi terapeutici, sarà necessaria una raccolta coerente di campioni e questo studio lo fornirà.

La seconda parte dello studio è progettata per comprendere la variabilità che può essere osservata nella composizione e nelle funzioni del microbioma intestinale dal punto di vista della proteomica. Il microbioma intestinale è dinamico ed è noto per essere alterato da molteplici fattori quali la dieta (Kolmeder et al., 2016), l'età (Ghosh et al., 2022), la genetica (Kurilshikov et al., 2021), l'ambiente (Nurkolis et al., 2021). al., 2022), ecc. Queste variazioni possono essere ampiamente classificate in inter- e intra-individuali. La variabilità interindividuale si riferisce alle differenze osservate tra individui all’interno di una popolazione o di un gruppo e può comprendere un’ampia gamma di caratteristiche, tra cui la composizione genetica, parametri fisiologici, fattori di stile di vita ed esposizioni ambientali. Comprendere la variabilità interindividuale delle persone della stessa “comunità” è essenziale in campi come la medicina personalizzata, dove interventi su misura tengono conto delle differenze individuali per ottimizzare i risultati del trattamento. La variabilità intra-individuale, invece, si riferisce a variazioni osservate all’interno dello stesso individuo nel tempo o in condizioni diverse e può derivare da fluttuazioni biologiche, come ritmi circadiani, fluttuazioni ormonali o risposte fisiologiche agli stimoli. Riconoscere e caratterizzare la variabilità intra-individuale è fondamentale per interpretare accuratamente i risultati della ricerca e valutare l'affidabilità delle misurazioni biologiche, in particolare negli studi longitudinali o negli scenari di monitoraggio clinico. Questo studio mira a comprendere queste variabilità attraverso i dati di proteomica raccolti dai campioni fecali dei partecipanti e definire le variabili rilevate nel microbioma intestinale.

C. Obiettivi:

1. Identificare l'effetto di cinque diversi tamponi utilizzati per la conservazione e il trasporto del materiale fecale umano raccolto, mediante profili metaproteomici.
2. Determinare la variabilità nel microbiota e nei proteomi dell’ospite a livello inter e intra-individuale.

D. Progettazione dello studio:

Per la prima fase, implementeremo il seguente protocollo per il campionamento fecale in loco e la conservazione durante il trasporto: ai partecipanti (reclutati tra i membri del nostro laboratorio/Divisione) verranno fornite 18 provette (numerate da 1 a 18; centrifuga conica da 15 ml provette; Ref# 339650, Thermo Scientific e 18 tamponi commerciali facili da usare (C1052-50, Zymo Research) o spatole (DNAGenotek). Le 18 provette corrispondono a tre punti temporali di conservazione di 6 diverse condizioni sperimentali: una provetta vuota (senza liquido di conservazione) come campione di controllo e 5 diversi liquidi di conservazione fecale non pericolosi: (a) Tampone interno (chiamato LB) con SDS e Urea, ottenuti commercialmente (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) tampone Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). In breve, LB, Zymo Shield e OM200 sono noti per contenere detergenti che aiutano a preservare le biomolecole, il tampone Copan Amies è un mezzo privo di nutrienti noto per mantenere le cellule vitali e ha dimostrato di avere applicazioni in culturomica, e ME200 è utile a base di solvente nelle applicazioni metabolomiche. Inoltre, i partecipanti riceveranno un raccoglitore di feci commerciale da esporre sopra la toilette per facilitare il campionamento fecale (Servoprax Stuhlfaenger, numero di riferimento H7 61000-50 da www.medundorg.de) e una piccola scatola con impacchi di ghiaccio in cui i tre controlli i campioni verranno conservati e trasportati al laboratorio. Questi campioni di controllo conservati nel ghiaccio sono fondamentali per valutare le prestazioni dei diversi tamponi di conservazione. I partecipanti porteranno i campioni presso il nostro laboratorio nelle 24 ore successive. Una volta ricevuti in laboratorio, i campioni di controllo verranno conservati a -80°C fino all'ulteriore elaborazione biochimica utilizzando protocolli stabiliti (Gómez-Varela et al., 2023). Il resto dei campioni verrà conservato a +20°C all'interno di un incubatore con agitatore orbitale per un totale di 2, 5 e 10 giorni (simulando diversi tempi di conservazione/trasporto). Al termine di questi tempi, i campioni verranno conservati a -80°C fino all'ulteriore trattamento biochimico utilizzando protocolli stabiliti (Gómez-Varela et al., 2023). I profili metaproteomici (che indicano i cambiamenti tassonomici e funzionali nel microbioma intestinale e nella fisiologia dell'ospite; come in Gomez-Varela, 2023 da questi campioni ci informeranno sul miglior liquido di conservazione (definito come quello in cui la composizione e la funzione del microbioma sono più come il campione di controllo). Questo esperimento è necessario per avviare la Fase II dello studio ed è nuovo nel campo in quanto non sono state stabilite linee guida per le migliori pratiche di campionamento fecale interno in metaproteomica. Verranno reclutati sei partecipanti sani (tra i membri del laboratorio di Systems Biology of Pain, Divisione di Farmacologia e Tossicologia, Dipartimento di Scienze Farmaceutiche). Questo è uno studio randomizzato senza gruppi di partecipanti. I campioni verranno raccolti una volta e distribuiti in 18 provette che rappresentano condizioni diverse. Una dimensione del campione di 6 soggetti sarà sufficiente per trovare la migliore soluzione di conservazione e il campionamento verrà eseguito una volta dai partecipanti durante il normale movimento intestinale. Inoltre, i partecipanti compileranno un questionario (allegato) che include informazioni come età, sesso, indice di massa corporea, scala di valutazione dei sintomi gastrointestinali (GSRS), somministrazione di antibiotici negli ultimi 30 giorni prima della raccolta del campione, modulo delle feci di Bristol scala (BSFS) e il tempo approssimativo necessario per la raccolta del campione nelle 18 provette (per tenere conto dei potenziali effetti dovuti ai processi di ossidazione).

Per la seconda fase, i partecipanti dovranno raccogliere campioni fecali per 4 settimane durante la loro regolare defecazione (dieci volte diverse al massimo). Verranno forniti un numero adeguato di provette coniche da centrifuga da 15 ml (339650, Thermo Scientific) contenenti il ​​tampone di conservazione più performante (come definito nella prima fase dello studio, vedere sopra) e un dispositivo di raccolta commerciale con un raccoglitore di feci . Una volta ricevuti in laboratorio, i campioni verranno conservati a -80°C fino al successivo trattamento biochimico utilizzando protocolli stabiliti. Inoltre, i partecipanti compileranno un questionario (vedi sopra). I partecipanti prenderanno parte volontariamente all'esperimento dopo aver ricevuto una spiegazione di tutti i rischi e i benefici derivanti dalla partecipazione al presente studio e dopo aver firmato il modulo di consenso informato scritto secondo la Dichiarazione di Helsinki (vedere il modulo di consenso allegato). I partecipanti verranno istruiti e forniti dei dispositivi di campionamento necessari per raccogliere campioni di feci (vedi sopra) e inviare i campioni al Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia il prima possibile. I partecipanti dovranno completare questionari autosomministrati che includono informazioni come quella sopra descritta. Per la seconda fase, verranno reclutati 46 partecipanti sani (tra i membri del nostro laboratorio/Divisione) di entrambi i sessi (23 maschi e femmine) considerando un possibile tasso di abbandono del 20%. Questo è uno studio randomizzato senza gruppi di partecipanti. La dimensione del campione è stata calcolata in base alla soglia delle stime di Eggerthella con il tempo riportato da Kaczmarek et al., 2017. La procedura statistica utilizzata è il test F: ANOVA a due vie con misure ripetute con i seguenti valori Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 e α= 0,05. Si prevede che verranno raccolti un totale di 400 - 460 campioni.

E. Riferimenti:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). La metaproteomica fecale rivela una ridotta infiammazione intestinale e un cambiamento del metabolismo microbico in seguito alla perdita di peso indotta dallo stile di vita. Biomolecole, 11(5), articolo 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T. S., Shanahan, F. e O'Toole, P. W. (2022). Il microbioma intestinale come modulatore di un invecchiamento sano. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Aumento della caratterizzazione tassonomica e funzionale delle interazioni ospite-microbioma mediante metaproteomica DIA-PASEF. Frontiere in microbiologia, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M. e Holscher, H. D. (2017). L’ora del giorno e i comportamenti alimentari sono associati alla composizione e alla funzione del microbiota gastrointestinale umano. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). La conservazione e l'archiviazione dei campioni hanno un impatto significativo sui profili tassonomici e funzionali negli studi di metaproteomica del microbioma intestinale umano. Microrganismi, 7(9), articolo 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A. e de Vos, WM (2016). L'analisi metaproteomica fecale rivela un microbioma funzionale personalizzato e stabile e effetti limitati di un intervento probiotico negli adulti. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Le analisi di associazione su larga scala identificano i fattori dell’ospite che influenzano la composizione del microbioma intestinale umano. Genetica della natura, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Stabilità del microbioma fecale umano in una coorte di uomini adulti. Microbiologia della natura, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A. e Kleiner, M. (2021). Valutazione dei metodi di conservazione e conservazione dei campioni per l'analisi metaproteomica dei microbiomi intestinali. Spettro microbiologico, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nizza, EC (2022). Lo stato della proteomica all’inizio degli anni ’20: verso una medicina personalizzata/di precisione. Biochimica analitica, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S., & Taslim, N. A. (2022). Attività umane e cambiamenti nel microbioma intestinale: una prospettiva. Nutrizione umana e metabolismo, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). La metaproteomica rivela associazioni tra microbioma e proteine ​​delle vescicole extracellulari intestinali nella malattia infiammatoria intestinale pediatrica. Comunicazioni sulla natura, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4