Het onderzoeken van de werkzaamheid van opslagbuffers in commerciële fases en het evalueren van de variabiliteit van het darmmetaproteoom tussen individuen (PROTEGI)

A. Inleiding:

Metaproteomics bestudeert het volledige eiwitcomplement van een microbiële gemeenschap en biedt inzicht in ingewikkelde ecosystemen zoals het darmmicrobioom. Metaproteomics stelt onderzoekers in staat diep in de darmmicrobiomen te duiken en inzicht te verschaffen in de overvloed en functionele activiteiten van deze microbiële bewoners. Deze kennis heeft een belangrijke rol gespeeld bij het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende ziekten, zoals inflammatoire darmziekten (Zhang et al., 2018) en obesitas (Biemann et al., 2021). Onderzoekers kunnen gerichte strategieën ontwikkelen voor gepersonaliseerde geneeskunde en precisiegezondheidszorg op basis van de onderliggende biologie (Nice, 2022) door belangrijke eiwitsignaturen te identificeren.

Bij onderzoeken naar het darmmicrobioom zijn gestandaardiseerde monsterverzameling en -bewaring bijzonder cruciaal om de integriteit van de microbiële gemeenschap en zijn proteoom te behouden. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen moet men rekening houden met de gevoeligheid voor omgevingsinvloeden zoals temperatuur en hoeveelheid zuurstof. Voor metaproteomische onderzoeken naar het darmmicrobioom wordt de voorkeur gegeven aan niet-invasieve of minimaal invasieve methoden om verstoring of contaminatie te minimaliseren en de oorspronkelijke microbiële samenstelling en eiwitprofielen te behouden. Ook beïnvloeden de strategieën voor het hanteren en bewaren van monsters de afbraak van eiwitten en de stabiliteit van de microbiële populatie. Om deze reden wordt onmiddellijk invriezen of bewaren bij lage temperaturen (bijvoorbeeld -80°C) vaak aanbevolen om de monsterintegriteit tot aan de analyse te behouden (Hickl et al., 2019). Het gebruik van een koelketen voor opslag en transport is echter niet verenigbaar met een bemonsteringsstrategie ter plaatse die noodzakelijk is voor grootschalige en gedelokaliseerde onderzoeken. Bovendien is het minder ideaal, duurder en logistiek omslachtiger dan mogelijke opties voor kamertemperatuur.

Bovendien is de huidige kennis van de methoden voor het verzamelen/conserveren van fecale monsters gebaseerd op het conserveren van nucleïnezuren of metabolieten tijdens het transport naar het laboratorium voor analyse. Het behoud van eiwitten vereist echter verschillende strategieën en studies zijn schaars en vertrouwen op het gebruik van de apparaten of reagentia die worden gebruikt in het geval van de analyse van nucleïnezuren of metabolieten (Mordant & Kleiner, 2021). Op maat gemaakte en gestandaardiseerde protocollen samen met het verzamelen van metagegevens zijn dus essentieel voor het garanderen van reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen metaproteomische onderzoeken.

De huidige studie heeft tot doel de geschiktheid van verschillende commerciële en niet-gevaarlijke buffers voor de opslag van fecale monsters van menselijke darmen in de loop van de tijd te evalueren. Fecale monsters worden opgeslagen in vijf verschillende buffers en worden gebenchmarkt met direct ingevroren monsters. Met behulp van metaproteomics zullen we de proteomische, taxonomische en functionele identificaties vergelijken om het potentieel van deze buffers als betrouwbare opslagoplossing voor menselijke uitwerpselen te begrijpen. Dit onderzoek is uniek en voor zover wij weten heeft geen enkel vergelijkbaar onderzoek deze veeleisende vraag beantwoord.

Voorlopig bewijs bij mensen heeft inter- en intra-individuele variabiliteit van de proteomen van de gastheer en microbiomen aangetoond (Mehta et al., 2018). Met name de intra-individuele taxonomische en functionele variatie in het darmmicrobioom lijkt in de loop van de tijd lager te zijn dan de inter-individuele variatie. Metatranscriptomics-profielen vertoonden echter een vergelijkbare variabiliteit binnen en tussen proefpersonen. Daarom willen we, met behulp van metaproteomics, de inter- en intra-individuele variabiliteiten op proteoomniveau beoordelen door fecale monsters te bestuderen die periodiek van deelnemers worden verzameld.

B. De academische en maatschappelijke relevantie:

Het eerste deel van de studie heeft tot doel de meest effectieve opslagbuffer te definiëren voor het behoud van de eiwitintegriteit tijdens monstertransport van de plaats van verzameling naar de plaats van verwerking - een sleutelfactor in de toekomst van metaproteomics toegepast op gezondheid en ziekte. Ondanks het belang ervan is er geen soortgelijke evaluatie uitgevoerd voor proteomische toepassingen. Deze kennis zal van cruciaal belang zijn voor academische doeleinden en kan worden gebruikt voor grootschalige menselijke fecale proteomische studies. Als mensen hun darmgezondheid willen laten onderzoeken door middel van metaproteomics en het potentieel van op microbiële gemeenschappen gebaseerde gepersonaliseerde geneeskunde en therapeutische interventies willen ontsluiten, zal er een vereiste zijn voor consistente monsterverzameling en deze studie zal hierin voorzien.

Het tweede deel van de studie is bedoeld om de variabiliteit te begrijpen die kan worden waargenomen in de samenstelling en functies van het darmmicrobioom vanuit proteomics-perspectief. Het darmmicrobioom is dynamisch en het is bekend dat het wordt veranderd door meerdere factoren, zoals voeding (Kolmeder et al., 2016), leeftijd (Ghosh et al., 2022), genetica (Kurilshikov et al., 2021), omgeving (Nurkolis et al. al., 2022), enz. Deze variaties kunnen grofweg worden ingedeeld in inter- en intra-individueel. Interindividuele variabiliteit verwijst naar de verschillen die worden waargenomen tussen individuen binnen een populatie of groep, en deze kunnen een breed scala aan kenmerken omvatten, waaronder genetische samenstelling, fysiologische parameters, levensstijlfactoren en blootstelling aan het milieu. Het begrijpen van de interindividuele variabiliteit van mensen uit dezelfde ‘gemeenschap’ is essentieel op gebieden als gepersonaliseerde geneeskunde, waar op maat gemaakte interventies rekening houden met individuele verschillen om de behandelresultaten te optimaliseren. Intra-individuele variabiliteit verwijst daarentegen naar variaties die binnen hetzelfde individu in de loop van de tijd of onder verschillende omstandigheden worden waargenomen en kunnen voortkomen uit biologische fluctuaties, zoals circadiane ritmes, hormonale fluctuaties of fysiologische reacties op stimuli. Het herkennen en karakteriseren van intra-individuele variabiliteit is cruciaal voor het nauwkeurig interpreteren van onderzoeksresultaten en het beoordelen van de betrouwbaarheid van biologische metingen, vooral in longitudinale onderzoeken of klinische monitoringscenario's. Deze studie heeft tot doel deze variabiliteiten te begrijpen door middel van de proteomics-gegevens verzameld uit de fecale monsters van deelnemers en de variabelen te definiëren die worden gedetecteerd in het darmmicrobioom.

C. Doelstellingen:

1. Het effect identificeren van vijf verschillende buffers die worden gebruikt voor de opslag en het transport van verzameld menselijk fecaal materiaal, aan de hand van metaproteomische profielen.
2. Om de variabiliteit in microbiota en gastheerproteomen op inter- en intra-individueel niveau te bepalen.

D. Studieontwerp:

Voor de eerste fase zullen we het volgende protocol hanteren voor fecale bemonstering ter plaatse en conservering tijdens transport: De deelnemers (geworven onder de leden van ons laboratorium/divisie) zullen worden voorzien van 18 buisjes (genummerd 1-18; conische centrifuge van 15 ml). buizen; Ref# 339650, Thermo Scientific en 18 eenvoudig te gebruiken commerciële wattenstaafjes (C1052-50, Zymo Research) of spatels (DNAGenotek). De 18 buisjes komen overeen met drie opslagtijdstippen van 6 verschillende experimentele omstandigheden: een leeg buisje (zonder conserveringsvloeistof) als controlemonster en 5 verschillende niet-gevaarlijke fecale conserveringsvloeistoffen: (a) Interne buffer (LB genoemd) met SDS en ureum, commercieel verkregen (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies-buffer (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). In het kort is bekend dat LB, Zymo Shield en OM200 detergentia bevatten die helpen de biomoleculen te behouden, Copan Amies-buffer is een voedingsvrij medium waarvan bekend is dat het de cellen levensvatbaar houdt en waarvan is aangetoond dat het toepassingen heeft in de culturomics, en ME200 is op oplosmiddelbasis nuttig in metabolomische toepassingen. Daarnaast ontvangen de deelnemers een commerciële ontlastingsvanger die boven het toilet wordt uitgestald om de fecale monstername te vergemakkelijken (Servoprax Stuhlfaenger, referentienummer H7 61000-50 van www.medundorg.de) en een doosje met koelelementen waarin de drie Control monsters worden opgeslagen en naar het laboratorium vervoerd. Deze in ijs opgeslagen controlemonsters zijn essentieel voor het evalueren van de prestaties van de verschillende opslagbuffers. De deelnemers brengen de monsters binnen 24 uur naar ons laboratorium. Bij ontvangst in het laboratorium worden de controlemonsters bij -80°C bewaard tot verdere biochemische verwerking met behulp van vastgestelde protocollen (Gómez-Varela et al., 2023). De rest van de monsters wordt in totaal 2, 5 en 10 dagen bij +20°C in een orbitale schudincubator bewaard (waarbij verschillende opslag-/transporttijden worden gesimuleerd). Aan het einde van deze tijdstippen worden de monsters bij -80°C bewaard tot verdere biochemische verwerking met behulp van vastgestelde protocollen (Gómez-Varela et al., 2023). De metaproteomische profielen (die de taxonomische en functionele veranderingen in het darmmicrobioom en de gastheerfysiologie aangeven; zoals in Gomez-Varela, 2023 uit deze monsters zullen ons informeren over de beste conserveringsvloeistof (gedefinieerd als degene waarbij de samenstelling en functie van het microbioom beter zijn). zoals het controlemonster). Dit experiment is nodig voor het initiëren van Fase II van het onderzoek, en het is nieuw in het veld omdat er geen richtlijnen zijn opgesteld voor de beste interne fecale bemonsteringspraktijken in metaproteomics. Er zullen zes gezonde deelnemers worden gerekruteerd (onder de leden van het laboratorium Systeembiologie van Pijn, Afdeling Farmacologie en Toxicologie, Afdeling Farmaceutische Wetenschappen). Dit is een gerandomiseerde studie zonder deelnemersgroepen. Er worden één keer monsters verzameld en verdeeld over 18 buisjes die verschillende omstandigheden vertegenwoordigen. Een steekproefomvang van 6 proefpersonen zal voldoende zijn om de beste conserveringsoplossing te vinden en de bemonstering zal één keer door de deelnemers worden uitgevoerd onder normale stoelgang. Daarnaast zullen de deelnemers een vragenlijst invullen (bijgevoegd) met informatie zoals leeftijd, geslacht, Body Mass Index, de gastro-intestinale symptomenbeoordelingsschaal (GSRS), toediening van antibiotica in de laatste 30 dagen vóór de monsterafname, het Bristol-ontlastingsformulier schaal (BSFS), en de geschatte tijd die nodig is voor monsterverzameling in de 18 buizen (om rekening te houden met mogelijke effecten als gevolg van oxidatieprocessen).

Voor de tweede fase wordt van de deelnemers verwacht dat ze gedurende 4 weken ontlastingsmonsters verzamelen tijdens hun reguliere ontlasting (maximaal tien verschillende keren). Ze zullen worden voorzien van een voldoende aantal conische centrifugebuisjes van 15 ml (339650, Thermo Scientific) die de best presterende conserveringsbuffer bevatten (zoals gedefinieerd in de eerste fase van het onderzoek, zie hierboven), en een commercieel verzamelapparaat met een ontlastingsvanger. . Bij ontvangst in het laboratorium worden de monsters bij -80°C bewaard tot verdere biochemische verwerking volgens vastgestelde protocollen. Daarnaast vullen de deelnemers een vragenlijst in (zie hierboven). Deelnemers nemen vrijwillig deel aan het experiment nadat ze uitleg hebben gekregen over alle risico's en voordelen van deelname aan het huidige onderzoek, en na ondertekening van het schriftelijke geïnformeerde toestemmingsformulier volgens de Verklaring van Helsinki (zie het toestemmingsformulier, bijgevoegd). De deelnemers zullen worden geïnstrueerd en voorzien van de benodigde bemonsteringsapparatuur om ontlastingsmonsters te verzamelen (zie hierboven) en de monsters zo snel mogelijk in te dienen bij de afdeling Farmacologie en Toxicologie. Van de deelnemers wordt verwacht dat zij zelf vragenlijsten invullen die informatie bevatten zoals hierboven beschreven. Voor de tweede fase zullen 46 gezonde deelnemers (onder de leden van ons laboratorium/divisie) worden gerekruteerd uit beide geslachten (23 mannen en vrouwen), rekening houdend met een mogelijk uitvalpercentage van 20%. Dit is een gerandomiseerde studie zonder deelnemersgroepen. De steekproefomvang werd berekend op basis van de drempelwaarde van Eggerthella-schattingen met tijd gerapporteerd door Kaczmarek et al., 2017. De gebruikte statistische procedure is F-tests - tweeweg-ANOVA met herhaalde metingen met de volgende waarden Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 en α= 0,05. Er zullen naar verwachting in totaal 400 - 460 monsters worden verzameld.

E. Referenties:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, JG, Saake, G., & Heyer, R. (2021). Fecale metaproteomics onthullen verminderde darmontstekingen en veranderd microbieel metabolisme na door levensstijl veroorzaakt gewichtsverlies. Biomoleculen, 11(5), artikel 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, TS, Shanahan, F., & O'Toole, PW (2022). Het darmmicrobioom als modulator van gezond ouder worden. Natuurrecensies Gastro-enterologie en hepatologie, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, JR, & Schmidt, M. (2023). Toenemende taxonomische en functionele karakterisering van gastheer-microbioom-interacties door DIA-PASEF-metaproteomics. Grenzen in de microbiologie, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, JL, Musaad, SM, & Holscher, HD (2017). Het tijdstip van de dag en het eetgedrag worden in verband gebracht met de samenstelling en functie van de menselijke gastro-intestinale microbiota. Het American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). Het bewaren en opslaan van monsters heeft een aanzienlijke impact op taxonomische en functionele profielen in metaproteomics-studies van het menselijke darmmicrobioom. Micro-organismen, 7(9), artikel 9. https://doi.org/10.3390/microorganismen7090367 Kolmeder, C.A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R.A., Corthals, G.L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, WM (2016). Fecale metaproteomische analyse onthult een gepersonaliseerd en stabiel functioneel microbioom en beperkte effecten van een probiotische interventie bij volwassenen. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C.I., Raygoza Garay, J.A., Finnicum, C.T., Liu, X. , Zhernakova, D.V., Bonder, M.J., Hansen, T.H., Frost, F., Rühlemann, M.C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Grootschalige associatieanalyses identificeren gastheerfactoren die de samenstelling van het menselijke darmmicrobioom beïnvloeden. Natuurgenetica, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R.S., Abu-Ali, G.S., Drew, D.A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A.D., Ivey, K.L., Khalili, H., Brown, G.T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, LH, Mallick, H., Rimm, EB, Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, AT (2018). Stabiliteit van het menselijke fecale microbioom in een cohort volwassen mannen. Natuurmicrobiologie, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Bijtmiddel, A., & Kleiner, M. (2021). Evaluatie van monsterconserverings- en opslagmethoden voor metaproteomics-analyse van darmmicrobiomen. Microbiologisch spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, EC (2022). De status van proteomics als we de jaren 2020 ingaan: op weg naar gepersonaliseerde/precisiegeneeskunde. Analytische biochemie, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, DS, & Taslim, NA (2022). Menselijke activiteiten en veranderingen in het darmmicrobioom: een perspectief. Menselijke voeding en metabolisme, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S.A., Ning, Z., Starr, A.E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomics onthult associaties tussen het microbioom en de eiwitten van de extracellulaire blaasjes in de darm bij inflammatoire darmziekten bij kinderen. Natuurcommunicatie, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4