Undersøke effektiviteten til kommersielle lagringsbuffere og evaluere tarmmetaproteomvariabiliteten mellom individer (PROTEGI)

A. Introduksjon:

Metaproteomics studerer hele proteinkomplementet til et mikrobielt samfunn og gir innsikt i intrikate økosystemer som tarmmikrobiomet. Metaproteomics lar forskere fordype seg dypt i tarmmikrobiomer, og gir innsikt i disse mikrobielle innbyggernes overflod og funksjonelle aktiviteter. Denne kunnskapen har vært medvirkende til å belyse mekanismene som ligger til grunn for ulike sykdommer, slik som inflammatorisk tarmsykdom (Zhang et al., 2018) og fedme (Biemann et al., 2021). Forskere kan utvikle målrettede strategier for personlig tilpasset medisin og presisjonshelsetjenester basert på den underliggende biologien (Nice, 2022) ved å identifisere nøkkelproteinsignaturer.

I tarmmikrobiomstudier er standardisert prøveinnsamling og bevaring spesielt avgjørende for å bevare integriteten til det mikrobielle samfunnet og dets proteom. Faktisk, for å oppnå pålitelige resultater må det vurderes følsomheten for miljøpåvirkninger som temperatur og oksygenmengde. For metaproteomiske studier av tarmmikrobiom foretrekkes ikke-invasive eller minimalt invasive metoder for å minimere forstyrrelser eller kontaminering, og bevare den opprinnelige mikrobielle sammensetningen og proteinprofilene. Også prøvehåndterings- og lagringsstrategiene påvirker nedbrytningen av proteiner og den mikrobielle populasjonsstabiliteten. Av denne grunn anbefales ofte umiddelbar frysing eller konservering ved lave temperaturer (f.eks. -80°C) for å opprettholde prøveintegriteten frem til analyse (Hickl et al., 2019). Å bruke en kjølekjede for lagring og transport er imidlertid ikke forenlig med en prøvetakingsstrategi på stedet som er nødvendig for store og delokaliserte studier. Dessuten er det mindre ideelt, dyrere og logistisk kjedelig enn potensielle romtemperaturalternativer.

Videre er dagens kunnskap om metodene for innsamling/konservering av fekal prøve basert på konservering av nukleinsyrer eller metabolitter under transporten til laboratoriet for analyse. Imidlertid krever proteinkonservering forskjellige strategier, og studier er knappe og er avhengige av å ta i bruk enhetene eller reagensene som brukes i tilfelle nukleinsyre- eller metabolitteranalyse (Mordant & Kleiner, 2021). Derfor er skreddersydde og standardiserte protokoller sammen med metadatainnsamling avgjørende for å sikre reproduserbarhet og sammenlignbarhet på tvers av metaproteomiske studier.

Denne studien tar sikte på å evaluere egnetheten til flere kommersielle og ikke-farlige buffere for lagring av menneskelige tarmfekale prøver over tid. Avføringsprøver vil bli lagret i fem forskjellige buffere og vil bli benchmarked med direkte frosne prøver. Ved å bruke metaproteomikk vil vi sammenligne de proteomiske, taksonomiske og funksjonelle identifikasjonene for å forstå potensialet til disse bufferne som en pålitelig lagringsløsning for menneskelig avføring. Denne forskningen er unik og så vidt vi vet har ingen lignende studie tatt opp dette krevende spørsmålet.

Foreløpige bevis hos mennesker har vist inter- og intra-individuell variasjon av proteomene til verten og mikrobiomene (Mehta et al., 2018). Spesielt ser den intra-individuelle taksonomiske og funksjonelle variasjonen i tarmmikrobiomet ut til å være lavere enn inter-individuell variasjon over tid. Imidlertid viste metatranskriptomiske profiler sammenlignbar variasjon innen og mellom fag. Derfor, ved å bruke metaproteomikk, tar vi sikte på å vurdere de inter- og intra-individuelle variasjonene på proteomnivå ved å studere avføringsprøver periodisk samlet inn fra deltakerne.

B. Den akademiske og sosiale relevansen:

Den første delen av studien tar sikte på å definere den mest effektive lagringsbufferen for å bevare proteinintegriteten under prøvetransport fra innsamlingsstedet til behandlingsstedet - en nøkkelfaktor i fremtiden for metaproteomikk brukt på helse og sykdom. Til tross for dens betydning, har en lignende evaluering ikke blitt utført for proteomiske applikasjoner. Denne kunnskapen vil være kritisk for akademiske formål som kan brukes til storskala human fekale proteomiske studier. For at folk skal få undersøkt tarmhelsen gjennom metaproteomikk og låse opp potensialet til mikrobielle samfunn-baserte persontilpassede medisiner og terapeutiske intervensjoner, vil det være et krav om konsekvent prøveinnsamling, og denne studien vil gi det.

Den andre delen av studien er designet for å forstå variasjonen som kan observeres i tarmmikrobiomets sammensetning og funksjoner fra et proteomikkperspektiv. Tarmmikrobiomet er dynamisk og er kjent for å bli endret av flere faktorer som kosthold (Kolmeder et al., 2016), alder (Ghosh et al., 2022), genetikk (Kurilshikov et al., 2021), miljø (Nurkolis et al. al., 2022), etc. Disse variasjonene kan bredt klassifiseres i inter- og intra-individuelle. Inter-individuell variasjon refererer til forskjellene observert mellom individer innenfor en populasjon eller gruppe, og de kan omfatte et bredt spekter av egenskaper, inkludert genetisk sammensetning, fysiologiske parametere, livsstilsfaktorer og miljøeksponeringer. Å forstå interindividuell variasjon fra mennesker i samme "fellesskap" er essensielt i felt som personlig medisin, der skreddersydde intervensjoner tar hensyn til individuelle forskjeller for å optimalisere behandlingsresultater. Intra-individuell variasjon, derimot, refererer til variasjoner observert innen samme individ over tid eller under forskjellige forhold og kan oppstå fra biologiske svingninger, som døgnrytmer, hormonelle svingninger eller fysiologiske responser på stimuli. Å gjenkjenne og karakterisere intra-individuell variabilitet er avgjørende for nøyaktig tolkning av forskningsresultater og vurdering av påliteligheten til biologiske målinger, spesielt i longitudinelle studier eller kliniske overvåkingsscenarier. Denne studien tar sikte på å forstå disse variasjonene gjennom proteomikkdataene samlet inn fra deltakernes fekale prøver og definere variablene som oppdages i tarmmikrobiomet.

C. Mål:

1. For å identifisere effekten av fem forskjellige buffere som brukes til lagring og transport av innsamlet menneskelig fekalt materiale, ved hjelp av metaproteomiske profiler.
2. For å bestemme variasjonen i mikrobiota og vertsproteomer på inter- og intra-individuelle nivåer.

D. Studiedesign:

For den første fasen vil vi implementere følgende protokoll for avføringsprøver på stedet og transportkonservering: Deltakerne (rekruttert blant medlemmene av vårt laboratorium/avdeling) vil bli utstyrt med 18 rør (nummerert 1-18; 15 ml konisk sentrifuge rør; Ref# 339650, Thermo Scientific og 18 brukervennlige kommersielle vattpinner (C1052-50, Zymo Research) eller spatler (DNAGenotek). De 18 rørene tilsvarer tre lagringstidspunkter med 6 forskjellige eksperimentelle forhold: et tomt rør (uten konserveringsvæske) som en kontrollprøve og 5 forskjellige ikke-farlige fekale konserveringsvæsker: (a) Intern buffer (kalt LB) med SDS og urea, kommersielt oppnådd (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies buffer (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). Kort fortalt er LB, Zymo Shield og OM200 kjent for å inneholde vaskemidler som hjelper til med å bevare biomolekylene, Copan Amies buffer er et næringsfritt medium kjent for å holde cellene levedyktige og har vist seg å ha bruksområder i kulturomikk, og ME200 er løsningsmiddelbasert nyttig. i metabolomiske applikasjoner. I tillegg vil deltakerne motta en kommersiell avføringsfanger som vises over toalettet for å lette avføringsprøvetaking (Servoprax Stuhlfaenger, referansenummer H7 61000-50 fra www.medundorg.de) og en liten boks med isposer der de tre Controller prøver vil bli lagret og fraktet til laboratoriet. Disse islagrede kontrollprøvene er nøkkelen til å evaluere ytelsen til de forskjellige lagringsbufferne. Deltakerne tar med prøvene til vårt laboratorium i løpet av de påfølgende 24 timene. Ved mottak i laboratoriet vil kontrollprøvene lagres ved -80°C inntil videre biokjemisk prosessering ved bruk av etablerte protokoller (Gómez-Varela et al., 2023). Resten av prøvene vil bli lagret ved +20°C inne i en orbital shaker inkubator i totalt 2, 5 og 10 dager (simulerer forskjellige lagrings-/transporttider derav). Ved slutten av disse tidspunktene vil prøvene lagres ved -80°C inntil videre biokjemisk prosessering ved bruk av etablerte protokoller (Gómez-Varela et al., 2023). De metaproteomiske profilene (som indikerer de taksonomiske og funksjonelle endringene i tarmmikrobiomet og vertsfysiologien; som i Gomez-Varela, 2023 fra disse prøvene vil informere oss om den beste konserveringsvæsken (definert som den der mikrobiomets sammensetning og funksjon er mer som kontrollprøven). Dette eksperimentet er nødvendig for å starte fase II av studien, og det er nytt på feltet da det ikke er etablert retningslinjer for beste interne fekale prøvetakingspraksis i metaproteomikk. Seks friske deltakere (blant medlemmene av Systems Biology of Pain-laboratoriet, avdeling for farmakologi og toksikologi, Institutt for farmasøytiske vitenskaper) vil bli rekruttert. Dette er en randomisert studie uten deltakergrupper. Prøver vil bli samlet inn én gang og fordelt på 18 rør som representerer forskjellige forhold. En prøvestørrelse på 6 forsøkspersoner vil være nok til å finne den beste konserveringsløsningen, og prøvetakingen vil bli utført én gang under normal avføring av deltakerne. I tillegg vil deltakerne fylle ut et spørreskjema (vedlagt) som inkluderer informasjon som alder, kjønn, kroppsmasseindeks, vurderingsskalaen for gastrointestinale symptomer (GSRS), administrering av antibiotika de siste 30 dagene før prøvetaking, Bristol avføringsskjemaet skala (BSFS), og den omtrentlige tiden som trengs for prøvetaking i de 18 rørene (for å ta hensyn til potensielle effekter på grunn av oksidasjonsprosesser).

For den andre fasen vil deltakerne forventes å samle avføringsprøver i 4 uker under deres vanlige avføring (maks ti forskjellige ganger). De vil bli utstyrt med et tilstrekkelig antall 15 ml koniske sentrifugerør (339650, Thermo Scientific) som inneholder den best presterende konserveringsbufferen (som definert i den første fasen av studien, se ovenfor), og en kommersiell oppsamlingsanordning med avføringsfanger . Ved mottak i laboratoriet vil prøvene lagres ved -80°C inntil videre biokjemisk prosessering ved bruk av etablerte protokoller. I tillegg skal deltakerne fylle ut et spørreskjema (se over). Deltakerne vil delta frivillig i eksperimentet etter å ha mottatt en forklaring på alle risikoene og fordelene ved å delta i denne studien, og etter å ha signert det skriftlige informerte samtykkeskjemaet i henhold til Helsinki-erklæringen (se samtykkeskjemaet, vedlagt). Deltakerne vil bli instruert og forsynt med nødvendig prøvetakingsutstyr for å samle avføringsprøver (se over) og levere prøvene til Institutt for farmakologi og toksikologi så snart som mulig. Deltakerne forventes å fylle ut selvadministrerte spørreskjemaer som inneholder informasjon som den som er beskrevet ovenfor. For den andre fasen vil 46 friske deltakere (blant medlemmene av vårt laboratorium/avdeling) rekrutteres fra begge kjønn (23 menn og kvinner) med tanke på en mulig frafallsprosent på 20 %. Dette er en randomisert studie uten deltakergrupper. Prøvestørrelsen ble beregnet basert på terskelen til Eggerthella-estimater med tid rapportert av Kaczmarek et al., 2017. Statistikkprosedyren som brukes er F-tester - toveis ANOVA med gjentatte mål med følgende verdier Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 og α=0,05. Det forventes samlet inn 400 - 460 prøver.

E. Referanser:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Fekal metaproteomikk avslører redusert tarmbetennelse og endret mikrobiell metabolisme etter livsstilsindusert vekttap. Biomolecules, 11(5), artikkel 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T.S., Shanahan, F., & O'Toole, P.W. (2022). Tarmmikrobiomet som en modulator for sunn aldring. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Økende taksonomisk og funksjonell karakterisering av vert-mikrobiom-interaksjoner ved DIA-PASEF-metaproteomikk. Frontiers in Microbiology, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M., & Holscher, H. D. (2017). Tid på dagen og spiseatferd er assosiert med sammensetningen og funksjonen til den menneskelige gastrointestinale mikrobiotaen. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). Prøvebevaring og -lagring har betydelig innvirkning på taksonomiske og funksjonelle profiler i metaproteomiske studier av det menneskelige tarmmikrobiomet. Microorganisms, 7(9), artikkel 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). Fekal metaproteomisk analyse avslører et personlig og stabilt funksjonelt mikrobiom og begrensede effekter av en probiotisk intervensjon hos voksne. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Storskala assosiasjonsanalyser identifiserer vertsfaktorer som påvirker menneskets tarmmikrobiomsammensetning. Nature Genetics, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Stabilitet av det menneskelige fekale mikrobiomet i en kohort av voksne menn. Nature Microbiology, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A., & Kleiner, M. (2021). Evaluering av prøvekonserverings- og lagringsmetoder for metaproteomisk analyse av intestinale mikrobiomer. Microbiology Spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, E. C. (2022). Statusen til proteomikk når vi går inn i 2020-årene: Mot personlig/presisjonsmedisin. Analytical Biochemistry, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D.S., & Taslim, N.A. (2022). Menneskelige aktiviteter og endringer i tarmmikrobiomet: Et perspektiv. Human Nutrition & Metabolism, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomikk avslører assosiasjoner mellom mikrobiom og intestinale ekstracellulære vesikkelproteiner i pediatrisk inflammatorisk tarmsykdom. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4