Sondando a eficácia dos buffers de armazenamento em estágio comercial e avaliando a variabilidade do metaproteoma intestinal entre indivíduos (PROTEGI)

A. Introdução:

A metaproteômica estuda todo o complemento proteico de uma comunidade microbiana e oferece informações sobre ecossistemas intricados, como o microbioma intestinal. A metaproteômica permite que os pesquisadores se aprofundem nos microbiomas intestinais, fornecendo insights sobre a abundância e as atividades funcionais desses habitantes microbianos. Este conhecimento tem sido fundamental para elucidar os mecanismos subjacentes a diversas doenças, como a doença inflamatória intestinal (Zhang et al., 2018) e a obesidade (Biemann et al., 2021). Os investigadores podem desenvolver estratégias direcionadas para medicina personalizada e cuidados de saúde de precisão com base na biologia subjacente (Nice, 2022), identificando assinaturas proteicas chave.

Nos estudos do microbioma intestinal, a recolha e preservação padronizada de amostras são particularmente cruciais para preservar a integridade da comunidade microbiana e do seu proteoma. Na verdade, para obter resultados confiáveis ​​deve-se considerar a suscetibilidade a influências ambientais como temperatura e quantidade de oxigênio. Para estudos metaproteômicos do microbioma intestinal, métodos não invasivos ou minimamente invasivos são preferidos para minimizar a interrupção ou contaminação e preservar a composição microbiana nativa e os perfis proteicos. Além disso, as estratégias de manuseio e armazenamento de amostras afetam a degradação de proteínas e a estabilidade da população microbiana. Por esta razão, o congelamento imediato ou a preservação em baixas temperaturas (por exemplo, -80°C) é frequentemente recomendado para manter a integridade da amostra até a análise (Hickl et al., 2019). No entanto, a utilização de uma cadeia de frio para armazenamento e transporte não é compatível com uma estratégia de amostragem no local que é necessária para estudos deslocalizados e em grande escala. Além disso, é menos ideal, mais caro e logisticamente tedioso do que possíveis opções de temperatura ambiente.

Além disso, o conhecimento atual dos métodos de coleta/preservação de amostras fecais baseia-se na preservação de ácidos nucléicos ou metabólitos durante o transporte para o laboratório para análise. Porém, a preservação de proteínas requer estratégias diferentes e os estudos são escassos e dependem da adoção dos dispositivos ou reagentes utilizados no caso de análise de ácidos nucléicos ou metabólitos (Mordant & Kleiner, 2021). Assim, protocolos personalizados e padronizados, juntamente com a coleta de metadados, são essenciais para garantir a reprodutibilidade e a comparabilidade entre estudos metaproteômicos.

O presente estudo tem como objetivo avaliar a adequação de vários tampões comerciais e não perigosos para o armazenamento de amostras fecais de intestino humano ao longo do tempo. Amostras fecais serão armazenadas em cinco tampões diferentes e serão comparadas com amostras diretamente congeladas. Usando metaproteômica, compararemos as identificações proteômicas, taxonômicas e funcionais para compreender o potencial desses tampões como uma solução confiável de armazenamento para fezes humanas. Esta pesquisa é única e, até onde sabemos, nenhum estudo semelhante abordou esta questão exigente.

Evidências preliminares em humanos mostraram variabilidade inter e intraindividual dos proteomas do hospedeiro e dos microbiomas (Mehta et al., 2018). Em particular, a variação taxonómica e funcional intraindividual no microbioma intestinal parece ser menor do que a variação interindividual ao longo do tempo. No entanto, os perfis metatranscriptômicos exibiram variabilidade comparável dentro e entre os indivíduos. Portanto, utilizando a metaproteômica, pretendemos avaliar as variabilidades inter e intra-individuais no nível do proteoma, estudando amostras fecais coletadas periodicamente dos participantes.

B. A relevância académica e social:

A primeira parte do estudo visa definir o tampão de armazenamento mais eficaz para preservar a integridade das proteínas durante o transporte da amostra do local de coleta até o local de processamento - um fator chave no futuro da metaproteômica aplicada à saúde e à doença. Apesar de sua importância, avaliação semelhante não foi realizada para aplicações proteômicas. Este conhecimento será fundamental para fins acadêmicos a serem utilizados em estudos proteômicos fecais humanos em larga escala. Para que as pessoas tenham a sua saúde intestinal examinada através da metaproteómica e libertem o potencial da medicina personalizada e das intervenções terapêuticas baseadas em comunidades microbianas, será necessária uma recolha consistente de amostras e este estudo irá fornecê-lo.

A segunda parte do estudo visa compreender a variabilidade que pode ser observada na composição e funções do microbioma intestinal do ponto de vista proteômico. O microbioma intestinal é dinâmico e sabe-se que é alterado por múltiplos fatores, como dieta (Kolmeder et al., 2016), idade (Ghosh et al., 2022), genética (Kurilshikov et al., 2021), ambiente (Nurkolis et al., 2021), ambiente (Nurkolis et al., 2021). al., 2022), etc. Essas variações podem ser amplamente classificadas em inter e intraindividuais. A variabilidade interindividual refere-se às diferenças observadas entre indivíduos dentro de uma população ou grupo e pode abranger uma ampla gama de características, incluindo composição genética, parâmetros fisiológicos, fatores de estilo de vida e exposições ambientais. Compreender a variabilidade interindividual de pessoas da mesma “comunidade” é essencial em áreas como a medicina personalizada, onde intervenções personalizadas levam em conta as diferenças individuais para otimizar os resultados do tratamento. A variabilidade intraindividual, por outro lado, refere-se a variações observadas dentro do mesmo indivíduo ao longo do tempo ou sob diferentes condições e pode surgir de flutuações biológicas, como ritmos circadianos, flutuações hormonais ou respostas fisiológicas a estímulos. Reconhecer e caracterizar a variabilidade intraindividual é crucial para interpretar com precisão os resultados da investigação e avaliar a fiabilidade das medições biológicas, particularmente em estudos longitudinais ou cenários de monitorização clínica. Este estudo tem como objetivo compreender essas variabilidades através dos dados proteômicos coletados nas amostras fecais dos participantes e definir as variáveis ​​​​detectadas no microbioma intestinal.

C. Objetivos:

1. Identificar o efeito de cinco diferentes tampões utilizados para armazenamento e transporte de material fecal humano coletado, por meio de perfis metaproteômicos.
2. Determinar a variabilidade na microbiota e nos proteomas do hospedeiro nos níveis inter e intraindividual.

D. Desenho do Estudo:

Para a primeira fase, implantaremos o seguinte protocolo para amostragem de fezes in loco e preservação de transporte: Os participantes (recrutados entre os membros do nosso laboratório/Divisão) receberão 18 tubos (numerados de 1 a 18; centrífuga cônica de 15 ml tubos Ref# 339650, Thermo Scientific e 18 swabs comerciais de fácil utilização (C1052-50, Zymo Research) ou espátulas (DNAGenotek). Os 18 tubos correspondem a três momentos de armazenamento de 6 condições experimentais diferentes: um tubo vazio (sem líquido de preservação) como amostra de controle e 5 líquidos diferentes de preservação fecais não perigosos: (a) Tampão interno (chamado LB) com SDS e Uréia, obtida comercialmente (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) tampão Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). Resumidamente, sabe-se que LB, Zymo Shield e OM200 contêm detergentes que ajudam a preservar as biomoléculas, o tampão Copan Amies é um meio livre de nutrientes conhecido por manter as células viáveis ​​e demonstrou ter aplicações em culturômica, e ME200 é útil à base de solvente. em aplicações metabolômicas. Além disso, os participantes receberão um coletor de fezes comercial que fica exposto sobre o vaso sanitário para facilitar a coleta de fezes (Servoprax Stuhlfaenger, número de referência H7 61000-50 de www.medundorg.de) e uma caixinha com bolsas de gelo nas quais os três controles as amostras serão armazenadas e transportadas para o laboratório. Essas amostras de controle armazenadas em gelo são essenciais para avaliar o desempenho dos diferentes buffers de armazenamento. Os participantes trarão as amostras para o nosso laboratório nas 24 horas seguintes. Após a recepção no laboratório, as amostras de Controle serão armazenadas a -80°C até posterior processamento bioquímico utilizando protocolos estabelecidos (Gómez-Varela et al., 2023). O restante das amostras será armazenado a +20°C dentro de uma incubadora agitadora orbital por um total de 2, 5 e 10 dias (simulando diferentes tempos de armazenamento/transporte). Ao final desses momentos, as amostras serão armazenadas a -80°C até posterior processamento bioquímico utilizando protocolos estabelecidos (Gómez-Varela et al., 2023). Os perfis metaproteômicos (indicando as mudanças taxonômicas e funcionais no microbioma intestinal e na fisiologia do hospedeiro; como em Gomez-Varela, 2023 a partir dessas amostras nos informarão sobre o melhor líquido de preservação (definido como aquele onde a composição e função do microbioma são mais como a amostra de controle). Este experimento é necessário para iniciar a Fase II do estudo e é novo no campo, pois nenhuma diretriz foi estabelecida para as melhores práticas internas de amostragem fecal em metaproteômica. Serão recrutados seis participantes saudáveis ​​​​(entre os membros do laboratório de Biologia de Sistemas da Dor, Divisão de Farmacologia e Toxicologia, Departamento de Ciências Farmacêuticas). Este é um estudo randomizado sem grupos de participantes. As amostras serão coletadas uma vez e distribuídas em 18 tubos representando diferentes condições. Um tamanho de amostra de 6 sujeitos será suficiente para encontrar a melhor solução de preservação e a amostragem será realizada uma vez sob evacuação normal pelos participantes. Além disso, os participantes preencherão um questionário (anexo) que inclui informações como idade, sexo, Índice de Massa Corporal, escala de avaliação de sintomas gastrointestinais (GSRS), administração de antibióticos nos últimos 30 dias antes da coleta da amostra, formulário de fezes de Bristol escala (BSFS) e o tempo aproximado necessário para a coleta da amostra nos 18 tubos (para levar em conta efeitos potenciais devido a processos de oxidação).

Para a segunda fase, os participantes deverão coletar amostras fecais por 4 semanas durante sua defecação regular (no máximo dez vezes diferentes). Eles receberão um número adequado de tubos de centrífuga cônicos de 15ml (339650, Thermo Scientific) contendo o tampão de preservação de melhor desempenho (conforme definido na primeira fase do estudo, veja acima) e um dispositivo de coleta comercial com coletor de fezes . Após a recepção no laboratório, as amostras serão armazenadas a -80°C até posterior processamento bioquímico utilizando protocolos estabelecidos. Além disso, os participantes preencherão um questionário (veja acima). Os participantes participarão voluntariamente do experimento após receberem uma explicação de todos os riscos e benefícios de participar do presente estudo, e após assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque (ver formulário de consentimento em anexo). Os participantes serão instruídos e receberão os dispositivos de amostragem necessários para coletar amostras de fezes (veja acima) e enviar as amostras ao Departamento de Farmacologia e Toxicologia na primeira oportunidade. Espera-se que os participantes preencham questionários autoadministrados que incluem informações como a descrita acima. Para a segunda fase, serão recrutados 46 participantes saudáveis ​​(entre os membros do nosso laboratório/Divisão) de ambos os sexos (23 homens e mulheres) considerando uma possível taxa de desistência de 20%. Este é um estudo randomizado sem grupos de participantes. O tamanho da amostra foi calculado com base no limite das estimativas de Eggerthella com o tempo relatado por Kaczmarek et al., 2017. O procedimento estatístico utilizado são testes F - ANOVA two-way com medidas repetidas com os seguintes valores Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 e α= 0,05. Espera-se que sejam coletadas um total de 400 a 460 amostras.

E. Referências:

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