Undersöka effektiviteten av kommersiella lagringsbuffertar och utvärdera tarmmetaproteomvariabiliteten mellan individer (PROTEGI)

A. Inledning:

Metaproteomics studerar hela proteinkomplementet i en mikrobiell gemenskap och ger insikt i komplicerade ekosystem som tarmmikrobiomet. Metaproteomics tillåter forskare att gräva djupt in i tarmmikrobiomer, vilket ger insikter om dessa mikrobiella invånares överflöd och funktionella aktiviteter. Denna kunskap har varit avgörande för att belysa mekanismerna bakom olika sjukdomar, såsom inflammatorisk tarmsjukdom (Zhang et al., 2018) och fetma (Biemann et al., 2021). Forskare kan utveckla riktade strategier för personlig medicin och precisionssjukvård baserat på den underliggande biologin (Nice, 2022) genom att identifiera viktiga proteinsignaturer.

I tarmmikrobiomstudier är standardiserad provinsamling och bevarande särskilt avgörande för att bevara integriteten hos det mikrobiella samhället och dess proteom. För att erhålla tillförlitliga resultat måste det faktiskt anses vara känsligt för miljöpåverkan som temperatur och syremängd. För metaproteomiska studier av tarmmikrobiom är icke-invasiva eller minimalt invasiva metoder att föredra för att minimera störningar eller kontaminering och bevara den naturliga mikrobiella sammansättningen och proteinprofilerna. Även provhanterings- och lagringsstrategierna påverkar nedbrytningen av proteiner och den mikrobiella populationens stabilitet. Av denna anledning rekommenderas ofta omedelbar frysning eller konservering vid låga temperaturer (t.ex. -80°C) för att bibehålla provets integritet fram till analys (Hickl et al., 2019). Att använda en kylkedja för lagring och transport är dock inte förenligt med en provtagningsstrategi på plats som är nödvändig för storskaliga och delokaliserade studier. Dessutom är det mindre idealiskt, dyrare och logistiskt tråkigt än potentiella rumstemperaturalternativ.

Vidare är nuvarande kunskap om metoderna för insamling/konservering av avföring baserad på bevarande av nukleinsyror eller metaboliter under transporten till laboratoriet för analys. Proteinkonservering kräver dock olika strategier och studier är knappa och förlitar sig på att anta de enheter eller reagenser som används vid analys av nukleinsyror eller metaboliter (Mordant & Kleiner, 2021). Därför är skräddarsydda och standardiserade protokoll tillsammans med metadatainsamling väsentliga för att säkerställa reproducerbarhet och jämförbarhet över metaproteomiska studier.

Den här studien syftar till att utvärdera lämpligheten hos flera kommersiella och ofarliga buffertar för lagring av mänskliga tarmprover över tid. Fekala prover kommer att lagras i fem olika buffertar och kommer att jämföras med direktfrysta prover. Med hjälp av metaproteomics kommer vi att jämföra de proteomiska, taxonomiska och funktionella identifikationerna för att förstå potentialen hos dessa buffertar som en pålitlig lagringslösning för mänsklig avföring. Denna forskning är unik och så vitt vi vet har ingen liknande studie tagit upp denna krävande fråga.

Preliminära bevis hos människor har visat inter- och intraindividuell variation av värdens proteomer och mikrobiomer (Mehta et al., 2018). I synnerhet verkar den intraindividuella taxonomiska och funktionella variationen i tarmmikrobiomet vara lägre än interindividuell variation över tid. Men metatranscriptomics profiler uppvisade jämförbar variation inom och mellan ämnen. Därför, med hjälp av metaproteomics, strävar vi efter att bedöma de inter- och intra-individuella variationerna på proteomnivån genom att studera fekala prover som regelbundet samlas in från deltagarna.

B. Den akademiska och sociala relevansen:

Den första delen av studien syftar till att definiera den mest effektiva lagringsbufferten för att bevara proteinintegriteten under provtransport från insamlingsplatsen till bearbetningsplatsen - en nyckelfaktor i framtiden för metaproteomik tillämpad på hälsa och sjukdom. Trots dess betydelse har en liknande utvärdering inte gjorts för proteomiska tillämpningar. Denna kunskap kommer att vara avgörande för akademiska syften för att användas för storskaliga mänskliga fekala proteomstudier. För att människor ska få sin tarmhälsa undersökt genom metaproteomik och låsa upp potentialen hos mikrobiella samhällen-baserade personlig medicin och terapeutiska interventioner kommer det att finnas ett krav på konsekvent provinsamling och denna studie kommer att tillhandahålla det.

Den andra delen av studien är utformad för att förstå den variation som kan observeras i tarmmikrobiomets sammansättning och funktioner ur ett proteomikperspektiv. Tarmmikrobiomet är dynamiskt och är känt för att förändras av flera faktorer som kost (Kolmeder et al., 2016), ålder (Ghosh et al., 2022), genetik (Kurilshikov et al., 2021), miljö (Nurkolis et al., 2022). al., 2022), etc. Dessa variationer kan brett klassificeras i inter- och intra-individuella. Interindividuell variabilitet avser de skillnader som observeras mellan individer inom en population eller grupp, och de kan omfatta ett brett spektrum av egenskaper, inklusive genetisk sammansättning, fysiologiska parametrar, livsstilsfaktorer och miljöexponeringar. Att förstå interindividuell variation från människor i samma "gemenskap" är väsentligt inom områden som personlig medicin, där skräddarsydda insatser tar hänsyn till individuella skillnader för att optimera behandlingsresultat. Intra-individuell variabilitet, å andra sidan, hänvisar till variationer som observerats inom samma individ över tid eller under olika förhållanden och kan uppstå från biologiska fluktuationer, såsom dygnsrytm, hormonella fluktuationer eller fysiologiska svar på stimuli. Att känna igen och karakterisera intraindividuell variabilitet är avgörande för att korrekt tolka forskningsresultat och bedöma tillförlitligheten av biologiska mätningar, särskilt i longitudinella studier eller kliniska övervakningsscenarier. Denna studie syftar till att förstå dessa variationer genom proteomikdata som samlats in från deltagarnas fekala prover och definiera de variabler som detekteras i tarmmikrobiomet.

C. Mål:

1. Att identifiera effekten av fem olika buffertar som används för lagring och transport av insamlat mänskligt fekalt material, genom metaproteomiska profiler.
2. Att bestämma variabiliteten i mikrobiota och värdproteomer på inter- och intraindividuella nivåer.

D. Studiedesign:

För den första fasen kommer vi att använda följande protokoll för avföringsprovtagning och transportkonservering på plats: Deltagarna (rekryterade bland medlemmarna i vårt laboratorium/division) kommer att förses med 18 rör (numrerade 1-18; 15 ml konisk centrifug rör; Ref# 339650, Thermo Scientific och 18 lättanvända kommersiella svabbar (C1052-50, Zymo Research) eller spatlar (DNAGenotek). De 18 rören motsvarar tre lagringstidpunkter med 6 olika experimentella förhållanden: ett tomt rör (utan konserveringsvätska) som kontrollprov och 5 olika ofarliga fekala konserveringsvätskor: (a) Intern buffert (kallad LB) med SDS och urea, kommersiellt erhållen (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies buffert (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). Kortfattat, LB, Zymo Shield och OM200 är kända för att innehålla rengöringsmedel som hjälper till att bevara biomolekylerna, Copan Amies buffert är ett näringsfritt medium känt för att hålla cellerna livskraftiga och har visat sig ha tillämpningar i culturomics, och ME200 är lösningsmedelsbaserad användbar i metabolomiska tillämpningar. Dessutom kommer deltagarna att få en kommersiell pallfångare som visas över toaletten för att underlätta avföringsprovtagning (Servoprax Stuhlfaenger, referensnummer H7 61000-50 från www.medundorg.de) och en liten låda med ispåsar där de tre Controller prover kommer att lagras och transporteras till labbet. Dessa islagrade kontrollprover är nyckeln till att utvärdera prestandan hos de olika lagringsbuffertarna. Deltagarna kommer att ta med sig proverna till vårt laboratorium inom de följande 24 timmarna. Vid mottagning i labbet kommer kontrollproverna att förvaras vid -80°C tills vidare biokemisk bearbetning med fastställda protokoll (Gómez-Varela et al., 2023). Resten av proverna kommer att förvaras vid +20°C i en orbital shaker-inkubator i totalt 2, 5 och 10 dagar (simulerar olika lagrings-/transporttider därav). Vid slutet av dessa tidpunkter kommer proverna att förvaras vid -80°C tills vidare biokemisk bearbetning med hjälp av etablerade protokoll (Gómez-Varela et al., 2023). De metaproteomiska profilerna (som indikerar de taxonomiska och funktionella förändringarna i tarmmikrobiomet och värdfysiologin; som i Gomez-Varela, 2023 från dessa prover kommer att informera oss om den bästa konserveringsvätskan (definierad som den där mikrobiomets sammansättning och funktion är mer som kontrollprovet). Detta experiment är nödvändigt för att initiera fas II av studien, och det är nytt på området eftersom inga riktlinjer har fastställts för bästa interna fekala provtagningsmetoder inom metaproteomik. Sex friska deltagare (bland medlemmarna i System Biology of Pain-laboratoriet, avdelningen för farmakologi och toxikologi, Institutionen för farmaceutiska vetenskaper) kommer att rekryteras. Detta är en randomiserad studie utan deltagargrupper. Prover kommer att samlas in en gång och distribueras till 18 rör som representerar olika förhållanden. En provstorlek på 6 försökspersoner kommer att räcka för att hitta den bästa konserveringslösningen och provtagningen kommer att utföras en gång under normal tarmrörelse av deltagarna. Dessutom kommer deltagarna att fylla i ett frågeformulär (bifogat) som innehåller information som ålder, kön, Body Mass Index, GSRS-skalan för gastrointestinala symtom, administrering av antibiotika under de senaste 30 dagarna före provtagning, Bristol-avföringsformuläret skala (BSFS), och den ungefärliga tiden som behövs för provtagning i de 18 rören (för att ta hänsyn till potentiella effekter på grund av oxidationsprocesser).

För den andra fasen förväntas deltagarna samla in fekala prover under 4 veckor under sin vanliga avföring (max tio olika gånger). De kommer att förses med ett tillräckligt antal 15 ml koniska centrifugrör (339650, Thermo Scientific) som innehåller den bäst presterande konserveringsbufferten (enligt definitionen i den första fasen av studien, se ovan), och en kommersiell uppsamlingsanordning med avföringsfångare . Vid mottagande i labbet kommer proverna att förvaras vid -80°C tills vidare biokemisk bearbetning med fastställda protokoll. Dessutom kommer deltagarna att fylla i ett frågeformulär (se ovan). Deltagarna kommer att delta frivilligt i experimentet efter att ha fått en förklaring av alla risker och fördelar med att delta i denna studie och efter att ha undertecknat det skriftliga informerade samtyckesformuläret enligt Helsingforsdeklarationen (se samtyckesformuläret, bifogat). Deltagarna kommer att instrueras och förses med nödvändiga provtagningsanordningar för att samla avföringsprover (se ovan) och lämna in proverna till Institutionen för farmakologi och toxikologi så snart som möjligt. Deltagarna förväntas fylla i självadministrativa frågeformulär som innehåller information som den som beskrivs ovan. För den andra fasen kommer 46 friska deltagare (bland medlemmarna i vårt laboratorium/division) att rekryteras från båda könen (23 män och kvinnor) med tanke på en möjlig avhopp på 20 %. Detta är en randomiserad studie utan deltagargrupper. Urvalsstorleken beräknades baserat på tröskeln för Eggerthella-uppskattningar med tid rapporterad av Kaczmarek et al., 2017. Statistikproceduren som används är F-tester - tvåvägs ANOVA med upprepade mätningar med följande värden Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 och α=0,05. Totalt förväntas 400 - 460 prover samlas in.

E. Referenser:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Fekal Metaproteomics avslöjar minskad tarminflammation och förändrad mikrobiell metabolism efter livsstilsinducerad viktminskning. Biomolecules, 11(5), artikel 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T.S., Shanahan, F., & O'Toole, P.W. (2022). Tarmmikrobiomet som en modulator av hälsosamt åldrande. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Ökad taxonomisk och funktionell karakterisering av värd-mikrobiom-interaktioner genom DIA-PASEF-metaproteomik. Frontiers in Microbiology, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M., & Holscher, H. D. (2017). Tid på dygnet och ätbeteenden är förknippade med sammansättningen och funktionen av den mänskliga gastrointestinala mikrobiotan. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). Provkonservering och -lagring påverkar avsevärt taxonomiska och funktionella profiler i metaproteomikstudier av den mänskliga tarmmikrobiomet. Microorganisms, 7(9), artikel 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). Fekal metaproteomisk analys avslöjar ett personligt och stabilt funktionellt mikrobiom och begränsade effekter av en probiotisk intervention hos vuxna. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova. , A. (2021). Storskaliga associationsanalyser identifierar värdfaktorer som påverkar människans tarmmikrobiomsammansättning. Nature Genetics, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Stabilitet av det mänskliga fekala mikrobiomet i en kohort av vuxna män. Nature Microbiology, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A., & Kleiner, M. (2021). Utvärdering av provkonserverings- och förvaringsmetoder för metaproteomisk analys av tarmmikrobiomer. Microbiology Spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, E. C. (2022). Proteomikens status när vi går in i 2020-talet: Mot personlig/precisionsmedicin. Analytical Biochemistry, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D.S., & Taslim, N.A. (2022). Mänskliga aktiviteter och förändringar i tarmmikrobiomet: ett perspektiv. Human Nutrition & Metabolism, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomics avslöjar samband mellan mikrobiom och intestinala extracellulära vesikelproteiner vid pediatrisk inflammatorisk tarmsjukdom. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4