Zkoumání účinnosti úložišť v komerční fázi a hodnocení variability střevního metaproteomu mezi jednotlivci (PROTEGI)

A. Úvod:

Metaproteomika studuje celý proteinový doplněk mikrobiální komunity a nabízí pohled do složitých ekosystémů, jako je střevní mikrobiom. Metaproteomika umožňuje výzkumníkům ponořit se hluboko do střevních mikrobiomů a poskytnout pohled na množství a funkční aktivity těchto mikrobiálních obyvatel. Tyto znalosti pomohly objasnit mechanismy, které jsou základem různých onemocnění, jako je zánětlivé onemocnění střev (Zhang et al., 2018) a obezita (Biemann et al., 2021). Výzkumníci mohou vyvinout cílené strategie pro personalizovanou medicínu a precizní zdravotní péči založenou na základní biologii (Nice, 2022) identifikací klíčových proteinových signatur.

Ve studiích střevního mikrobiomu je standardizovaný odběr vzorků a jejich uchovávání zvláště důležité pro zachování integrity mikrobiální komunity a jejího proteomu. Abychom získali spolehlivé výsledky, je třeba vzít v úvahu náchylnost k okolním vlivům, jako je teplota a množství kyslíku. Pro metaproteomické studie střevního mikrobiomu jsou preferovány neinvazivní nebo minimálně invazivní metody, aby se minimalizovalo narušení nebo kontaminace a zachovalo se přirozené mikrobiální složení a profily proteinů. Také manipulace se vzorky a strategie skladování ovlivňují degradaci proteinů a stabilitu mikrobiální populace. Z tohoto důvodu se často doporučuje okamžité zmrazení nebo konzervace při nízkých teplotách (např. -80 °C), aby byla zachována integrita vzorku až do analýzy (Hickl et al., 2019). Použití chladicího řetězce pro skladování a přepravu však není slučitelné se strategií odběru vzorků na místě, která je nezbytná pro rozsáhlé a delokalizované studie. Navíc je to méně ideální, dražší a logisticky únavné než potenciální možnosti pokojové teploty.

Současné znalosti o metodách odběru/konzervace vzorků stolice jsou navíc založeny na uchování nukleových kyselin nebo metabolitů během přepravy do laboratoře k analýze. Konzervace proteinů však vyžaduje různé strategie a studie jsou vzácné a spoléhají na přijetí zařízení nebo činidel používaných v případě analýzy nukleových kyselin nebo metabolitů (Mordant & Kleiner, 2021). Proto jsou přizpůsobené a standardizované protokoly spolu se sběrem metadat nezbytné pro zajištění reprodukovatelnosti a srovnatelnosti napříč metaproteomickými studiemi.

Cílem této studie je vyhodnotit vhodnost několika komerčních a zdravotně nezávadných pufrů pro skladování vzorků stolice z lidského střeva v průběhu času. Vzorky stolice budou uloženy v pěti různých pufrech a budou porovnávány s přímo zmrazenými vzorky. Pomocí metaproteomiky porovnáme proteomické, taxonomické a funkční identifikace, abychom pochopili potenciál těchto pufrů jako spolehlivého řešení pro ukládání lidských výkalů. Tento výzkum je jedinečný a pokud je nám známo, žádná podobná studie se touto náročnou otázkou nezabývala.

Předběžné důkazy u lidí ukázaly inter- a intraindividuální variabilitu proteomů hostitele a mikrobiomů (Mehta et al., 2018). Zejména intraindividuální taxonomická a funkční variace ve střevním mikrobiomu se zdá být v průběhu času nižší než interindividuální variace. Metatranskriptomické profily však vykazovaly srovnatelnou variabilitu v rámci subjektů a mezi subjekty. S využitím metaproteomiky se proto snažíme posoudit inter- a intraindividuální variabilitu na úrovni proteomu studiem vzorků stolice pravidelně odebraných od účastníků.

B. Akademický a společenský význam:

První část studie si klade za cíl definovat nejúčinnější úložný pufr pro zachování integrity proteinu během transportu vzorku z místa odběru do místa zpracování – klíčový faktor budoucnosti metaproteomiky aplikované na zdraví a nemoci. Navzdory jeho důležitosti nebylo podobné hodnocení provedeno pro proteomické aplikace. Tyto znalosti budou kritické pro akademické účely, které budou použity pro rozsáhlé lidské fekální proteomické studie. Aby si lidé nechali vyšetřit své střevní zdraví pomocí metaproteomiky a odemkli potenciál personalizované medicíny založené na mikrobiálních komunitách a terapeutických intervencí, bude potřeba konzistentní sběr vzorků a tato studie to poskytne.

Druhá část studie je navržena tak, aby porozuměla variabilitě, kterou lze pozorovat ve složení a funkcích střevního mikrobiomu z pohledu proteomiky. Střevní mikrobiom je dynamický a je známo, že je měněn mnoha faktory, jako je strava (Kolmeder et al., 2016), věk (Ghosh et al., 2022), genetika (Kurilshikov et al., 2021), prostředí (Nurkolis et al., 2022). al., 2022) atd. Tyto variace lze obecně rozdělit na inter- a intra-individuální. Interindividuální variabilita se týká rozdílů pozorovaných mezi jednotlivci v rámci populace nebo skupiny a může zahrnovat širokou škálu charakteristik, včetně genetické výbavy, fyziologických parametrů, faktorů životního stylu a expozice životního prostředí. Pochopení interindividuální variability od lidí ze stejné „komunity“ je zásadní v oborech, jako je personalizovaná medicína, kde intervence na míru zohledňují individuální rozdíly za účelem optimalizace výsledků léčby. Na druhé straně intraindividuální variabilita se týká variací pozorovaných u stejného jedince v průběhu času nebo za různých podmínek a může vzniknout z biologických fluktuací, jako jsou cirkadiánní rytmy, hormonální fluktuace nebo fyziologické reakce na podněty. Rozpoznání a charakterizace intraindividuální variability je zásadní pro přesnou interpretaci výsledků výzkumu a posouzení spolehlivosti biologických měření, zejména v longitudinálních studiích nebo scénářích klinického monitorování. Tato studie si klade za cíl porozumět těmto variabilitám prostřednictvím proteomických dat shromážděných ze vzorků stolice účastníků a definovat proměnné detekované ve střevním mikrobiomu.

C. Cíle:

1. Identifikovat účinek pěti různých pufrů používaných pro skladování a přepravu odebraného lidského fekálního materiálu pomocí metaproteomických profilů.
2. Stanovit variabilitu mikrobioty a hostitelských proteomů na inter- a intraindividuální úrovni.

D. Návrh studie:

Pro první fázi nasadíme následující protokol pro odběr vzorků stolice a transportní konzervaci na místě: Účastníci (rekrutovaní z řad členů naší laboratoře/divize) dostanou 18 zkumavek (očíslovaných 1-18; 15ml kónická odstředivka zkumavky č. 339650, Thermo Scientific a 18 snadno použitelných komerčních tamponů (C1052-50, Zymo Research) nebo špachtle (DNAGenotek). 18 zkumavek odpovídá třem časovým bodům skladování 6 různých experimentálních podmínek: prázdná zkumavka (bez konzervační kapaliny) jako kontrolní vzorek a 5 různých zdravotně nezávadných fekálních konzervačních kapalin: (a) Interní pufr (nazývaný LB) s SDS a Urea, komerčně získaná (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) pufr Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). Stručně řečeno, je známo, že LB, Zymo Shield a OM200 obsahují detergenty, které pomáhají chránit biomolekuly, pufr Copan Amies je médium bez živin, o kterém je známo, že udržuje buňky životaschopné a prokázalo se, že má aplikace v kultuře, a ME200 je užitečný na bázi rozpouštědla. v metabolomických aplikacích. Kromě toho účastníci obdrží komerční lapač stolice, který je vystaven nad toaletou pro usnadnění odběru vzorků stolice (Servoprax Stuhlfaenger, referenční číslo H7 61000-50 z www.medundorg.de) a malou krabičku s ledovými balíčky, ve kterých jsou tři kontrolní vzorky budou uloženy a převezeny do laboratoře. Tyto kontrolní vzorky uložené v ledu jsou klíčem k vyhodnocení výkonu různých vyrovnávacích pamětí. Účastníci přinesou vzorky do naší laboratoře během následujících 24 hodin. Po přijetí do laboratoře budou kontrolní vzorky skladovány při -80 °C až do dalšího biochemického zpracování pomocí zavedených protokolů (Gómez-Varela et al., 2023). Zbytek vzorků bude skladován při +20 °C v orbitálním třepacím inkubátoru po dobu celkem 2, 5 a 10 dnů (z toho simulující různé doby skladování/přepravy). Na konci těchto časových bodů budou vzorky skladovány při -80 °C až do dalšího biochemického zpracování pomocí zavedených protokolů (Gómez-Varela et al., 2023). Metaproteomické profily (označující taxonomické a funkční změny ve střevním mikrobiomu a fyziologii hostitele; jako v Gomez-Varela, 2023 z těchto vzorků nás informují o nejlepší konzervační kapalině (definované jako ta, kde je složení a funkce mikrobiomu více jako kontrolní vzorek). Tento experiment je nezbytný pro zahájení fáze II studie a je v oboru nový, protože nejsou stanoveny žádné pokyny pro nejlepší interní postupy odběru vzorků stolice v metaproteomice. Bude přijato šest zdravých účastníků (mezi členy laboratoře systémové biologie bolesti, oddělení farmakologie a toxikologie, katedra farmaceutických věd). Jedná se o randomizovanou studii bez skupin účastníků. Vzorky budou odebrány jednou a rozděleny do 18 zkumavek představujících různé podmínky. Velikost vzorku 6 subjektů bude stačit k nalezení nejlepšího konzervačního řešení a vzorkování bude účastníky provedeno jednou za normálního pohybu střev. Kromě toho účastníci vyplní dotazník (v příloze), který obsahuje informace, jako je věk, pohlaví, index tělesné hmotnosti, stupnice hodnocení gastrointestinálních symptomů (GSRS), podávání antibiotik v posledních 30 dnech před odběrem vzorku, formulář Bristolské stolice stupnice (BSFS) a přibližnou dobu potřebnou k odběru vzorku v 18 zkumavkách (k zohlednění potenciálních účinků v důsledku oxidačních procesů).

Ve druhé fázi se očekává, že účastníci budou odebírat vzorky stolice po dobu 4 týdnů během jejich pravidelné defekace (maximálně deset různých časů). Budou opatřeny odpovídajícím počtem 15ml kónických centrifugačních zkumavek (339650, Thermo Scientific) obsahujících nejvýkonnější konzervační pufr (jak je definován v první fázi studie, viz výše) a komerční sběrné zařízení se zachycovačem stolice. . Po přijetí do laboratoře budou vzorky skladovány při -80 °C až do dalšího biochemického zpracování pomocí zavedených protokolů. Kromě toho účastníci vyplní dotazník (viz výše). Účastníci se dobrovolně zúčastní experimentu poté, co obdrží vysvětlení všech rizik a přínosů účasti v této studii a po podepsání písemného formuláře informovaného souhlasu podle Helsinské deklarace (viz formulář souhlasu v příloze). Účastníci budou instruováni a vybaveni potřebnými odběrovými zařízeními k odběru vzorků stolice (viz výše) a k jejich odevzdání na Ústav farmakologie a toxikologie při nejbližší příležitosti. Od účastníků se očekává, že vyplní samostatně vytvořené dotazníky, které budou obsahovat informace, jako je ten, který je popsán výše. Pro druhou fázi bude vybráno 46 zdravých účastníků (mezi členy naší laboratoře/Divize) obou pohlaví (23 mužů a žen) s ohledem na možnou míru předčasného ukončení ve výši 20 %. Jedná se o randomizovanou studii bez skupin účastníků. Velikost vzorku byla vypočtena na základě prahu odhadů Eggerthella s časem, který uvedl Kaczmarek et al., 2017. Použitý statistický postup je F testy - dvoucestná ANOVA s opakovanými měřeními s následujícími hodnotami Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 a α= 0,05. Předpokládá se, že bude odebráno celkem 400 - 460 vzorků.

E. Reference:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Fekální metaproteomika odhaluje snížený zánět střev a změněný mikrobiální metabolismus po hubnutí vyvolaném životním stylem. Biomolecules, 11(5), Article 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T. S., Shanahan, F., & O'Toole, P. W. (2022). Střevní mikrobiom jako modulátor zdravého stárnutí. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Zvýšení taxonomické a funkční charakterizace interakcí hostitel-mikrobiom pomocí metaproteomiky DIA-PASEF. Hranice mikrobiologie, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M., & Holscher, H. D. (2017). Denní doba a stravovací návyky jsou spojeny se složením a funkcí lidské gastrointestinální mikroflóry. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P., & Becher, D. (2019). Uchovávání a skladování vzorků významně ovlivňuje taxonomické a funkční profily v metaproteomických studiích lidského střevního mikrobiomu. Mikroorganismy, 7(9), článek 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). Metaproteomická analýza stolice odhaluje personalizovaný a stabilní funkční mikrobiom a omezené účinky probiotické intervence u dospělých. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Rozsáhlé asociační analýzy identifikují hostitelské faktory ovlivňující složení lidského střevního mikrobiomu. Nature Genetics, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Stabilita lidského fekálního mikrobiomu u kohorty dospělých mužů. Nature Microbiology, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A., & Kleiner, M. (2021). Hodnocení metod uchovávání a uchovávání vzorků pro metaproteomickou analýzu střevních mikrobiomů. Microbiology Spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, E. C. (2022). Stav proteomiky, když vstupujeme do roku 2020: Směrem k personalizované/přesné medicíně. Analytical Biochemistry, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S., & Taslim, N. A. (2022). Lidské aktivity a změny ve střevním mikrobiomu: Perspektiva. Lidská výživa a metabolismus, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, SA, Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A., & Figeys, D. (2018). Metaproteomika odhaluje souvislosti mezi mikrobiomem a proteiny intestinálních extracelulárních vezikul u dětského zánětlivého onemocnění střev. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4