Kaupallisten vaiheiden säilytyspuskurien tehokkuuden tutkiminen ja suoliston metaproteomien vaihtelu yksilöiden välillä (PROTEGI)

A. Johdanto:

Metaproteomiikka tutkii mikrobiyhteisön koko proteiinikomplementtia ja tarjoaa tietoa monimutkaisista ekosysteemeistä, kuten suoliston mikrobiomista. Metaproteomiikka antaa tutkijoille mahdollisuuden sukeltaa syvälle suoliston mikrobiomiin ja antaa tietoa näiden mikrobien asukkaiden runsaudesta ja toiminnallisesta toiminnasta. Tämä tieto on auttanut selvittämään eri sairauksien, kuten tulehduksellisen suolistosairauden (Zhang et al., 2018) ja liikalihavuuden (Biemann et al., 2021), taustalla olevia mekanismeja. Tutkijat voivat kehittää kohdennettuja strategioita henkilökohtaiseen lääketieteeseen ja täsmäterveydenhuoltoon, jotka perustuvat taustalla olevaan biologiaan (Nizza, 2022) tunnistamalla tärkeimmät proteiinien allekirjoitukset.

Suoliston mikrobiomitutkimuksissa standardoitu näytteiden kerääminen ja säilyttäminen ovat erityisen tärkeitä mikrobiyhteisön ja sen proteomin eheyden säilyttämiseksi. Luotettavien tulosten saamiseksi on todellakin otettava huomioon alttius ympäristön vaikutuksille, kuten lämpötilalle ja happimäärälle. Suoliston mikrobiomin metaproteomisissa tutkimuksissa ei-invasiiviset tai minimaalisesti invasiiviset menetelmät ovat edullisia häiriöiden tai kontaminaation minimoimiseksi ja alkuperäisen mikrobikoostumuksen ja proteiiniprofiilien säilyttämiseksi. Myös näytteen käsittely- ja varastointistrategiat vaikuttavat proteiinien hajoamiseen ja mikrobipopulaation vakauteen. Tästä syystä välitöntä pakastamista tai säilytystä alhaisissa lämpötiloissa (esim. -80 °C) suositellaan usein näytteen eheyden säilyttämiseksi analyysiin asti (Hickl et al., 2019). Kylmäketjun käyttö varastointiin ja kuljetukseen ei kuitenkaan ole yhteensopivaa paikan päällä tapahtuvan näytteenottostrategian kanssa, joka on välttämätön laajamittaisissa ja siirretyissä tutkimuksissa. Lisäksi se on vähemmän ihanteellinen, kalliimpi ja logistisesti työläs kuin mahdolliset huonelämpötilavaihtoehdot.

Lisäksi nykyinen tietämys ulostenäytteiden keräys-/säilöntämenetelmistä perustuu nukleiinihappojen tai aineenvaihduntatuotteiden säilöntään laboratorioon analysoitavaksi kuljetuksen aikana. Proteiinien säilyttäminen vaatii kuitenkin erilaisia ​​strategioita ja tutkimuksia on vähän ja ne perustuvat nukleiinihappojen tai metaboliittien analyysissä käytettyjen laitteiden tai reagenssien käyttöön (Mordant & Kleiner, 2021). Näin ollen räätälöidyt ja standardoidut protokollat ​​yhdessä metatietojen keruun kanssa ovat välttämättömiä metaproteomisten tutkimusten toistettavuuden ja vertailukelpoisuuden varmistamiseksi.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on arvioida useiden kaupallisten ja vaarattomien puskureiden soveltuvuutta ihmisen suoliston ulostenäytteiden säilytykseen ajan myötä. Ulostenäytteet varastoidaan viiteen eri puskuriin ja niitä verrataan suoraan pakastettujen näytteiden kanssa. Metaproteomiikkaa käyttämällä vertaamme proteomisia, taksonomisia ja toiminnallisia tunnisteita ymmärtääksemme näiden puskurien potentiaalin luotettavana säilytysratkaisuna ihmisen ulosteille. Tämä tutkimus on ainutlaatuinen, ja parhaan tietomme mukaan mikään vastaava tutkimus ei ole käsitellyt tätä vaativaa kysymystä.

Alustavat todisteet ihmisillä ovat osoittaneet isännän proteomien ja mikrobiomien välistä ja yksilöiden välistä vaihtelua (Mehta et al., 2018). Erityisesti yksilöiden välinen taksonominen ja toiminnallinen vaihtelu suoliston mikrobiomissa näyttää olevan pienempi kuin yksilöiden välinen vaihtelu ajan myötä. Kuitenkin metatranskriptomiikkaprofiilit osoittivat vertailukelpoista vaihtelua koehenkilöiden sisällä ja välillä. Siksi pyrimme metaproteomiikkaa käyttämällä arvioimaan yksilöiden välisiä ja yksilöiden sisäisiä vaihteluita proteomitasolla tutkimalla osallistujilta säännöllisesti kerättyjä ulostenäytteitä.

B. Akateeminen ja sosiaalinen merkitys:

Tutkimuksen ensimmäisessä osassa pyritään määrittelemään tehokkain säilytyspuskuri proteiinin eheyden säilyttämiseksi näytteen kuljetuksen aikana keräyspaikasta käsittelypaikkaan. Tämä on keskeinen tekijä terveyteen ja sairauksiin sovellettavan metaproteomiikan tulevaisuuden kannalta. Sen tärkeydestä huolimatta vastaavaa arviointia ei ole suoritettu proteomisille sovelluksille. Tämä tieto on kriittistä akateemisiin tarkoituksiin käytettäväksi laajamittaisissa ihmisen ulosteen proteomitutkimuksissa. Jotta ihmiset voivat tutkia suoliston terveyttä metaproteomiikan avulla ja vapauttaa mikrobiyhteisöihin perustuvan yksilöllisen lääketieteen ja terapeuttisten interventioiden mahdollisuudet, vaaditaan johdonmukaista näytteenottoa, ja tämä tutkimus tarjoaa sen.

Tutkimuksen toinen osa on suunniteltu ymmärtämään suoliston mikrobiomin koostumuksessa ja toiminnassa havaittavissa olevaa vaihtelua proteomiikan näkökulmasta. Suoliston mikrobiomi on dynaaminen ja sen tiedetään muuttavan useiden tekijöiden, kuten ruokavalion (Kolmeder et al., 2016), iän (Ghosh et al., 2022), geneettisen (Kurilshikov et al., 2021), ympäristön (Nurkolis et al., 2021) vaikutuksesta. al., 2022) jne. Nämä vaihtelut voidaan luokitella laajasti yksilöiden välisiin ja yksilöiden sisäisiin. Yksilöiden välinen vaihtelu viittaa yksilöiden välillä havaittuihin eroihin populaation tai ryhmän sisällä, ja ne voivat sisältää laajan valikoiman ominaisuuksia, mukaan lukien geneettinen rakenne, fysiologiset parametrit, elämäntapatekijät ja ympäristöaltistukset. Samaan "yhteisöön" kuuluvien ihmisten yksilöiden välisen vaihtelun ymmärtäminen on olennaista sellaisilla aloilla kuin henkilökohtainen lääketiede, jossa räätälöidyt interventiot ottavat huomioon yksilölliset erot hoidon tulosten optimoimiseksi. Yksilön sisäinen vaihtelu puolestaan ​​viittaa vaihteluihin, joita havaitaan saman yksilön sisällä ajan kuluessa tai eri olosuhteissa, ja ne voivat johtua biologisista vaihteluista, kuten vuorokausirytmeistä, hormonaalisista vaihteluista tai fysiologisista vasteista ärsykkeisiin. Yksilön sisäisen vaihtelun tunnistaminen ja karakterisointi on erittäin tärkeää tutkimustulosten tarkan tulkinnan ja biologisten mittausten luotettavuuden arvioimiseksi, erityisesti pitkittäistutkimuksissa tai kliinisissä seurantaskenaarioissa. Tässä tutkimuksessa pyritään ymmärtämään näitä vaihteluita osallistujien ulostenäytteistä kerättyjen proteomiikkatietojen avulla ja määrittelemään suoliston mikrobiomissa havaitut muuttujat.

C. Tavoitteet:

1. Tunnistaa viiden erilaisen puskurin vaikutus kerätyn ihmisen ulostemateriaalin varastointiin ja kuljetukseen metaproteomisten profiilien perusteella.
2. Määrittää mikrobiotan ja isäntäproteomien vaihtelua yksilöiden välisellä ja sisäisellä tasolla.

D. Tutkimussuunnittelu:

Ensimmäisessä vaiheessa käytämme seuraavaa protokollaa paikan päällä tapahtuvaan ulosteen näytteenottoon ja kuljetuksen säilyttämiseen: Osallistujille (jotka on rekrytoitu laboratoriomme/osastomme jäsenistä) toimitetaan 18 putkea (numerot 1-18; 15 ml kartiomainen sentrifugi putket, viitenumero 339650, Thermo Scientific ja 18 helppokäyttöistä kaupallista vanupuikkoa (C1052-50, Zymo Research) tai lastaa (DNAGenotek). 18 putkea vastaavat kolmea varastointiaikapistettä 6 eri koeolosuhteissa: tyhjä putki (ilman säilöntänestettä) kontrollinäytteenä ja 5 erilaista vaaratonta ulosteensäilöntänestettä: (a) Talon sisäinen puskuri (kutsutaan LB:ksi), jossa on SDS ja urea, kaupallisesti hankittu (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) Copan Amies -puskuri (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet • GUT (ME200, DNAGenotek). Lyhyesti sanottuna LB:n, Zymo Shieldin ja OM200:n tiedetään sisältävän pesuaineita, jotka auttavat säilyttämään biomolekyylejä, Copan Amies -puskuri on ravinteeton väliaine, jonka tiedetään pitävän solut elinkelpoisina ja jolla on osoitettu olevan sovelluksia kulttuuritekniikassa, ja ME200 on liuotinpohjainen hyödyllinen. metabolomisissa sovelluksissa. Lisäksi osallistujat saavat kaupallisen jakkarakerääjän, joka on esillä wc-istuimen päällä ulostenäytteen ottoa varten (Servoprax Stuhlfaenger, viitenumero H7 61000-50 osoitteesta www.medundorg.de) ja pienen laatikon, jossa on jääpakkauksia, joissa on kolme kontrollia. näytteet säilytetään ja kuljetetaan laboratorioon. Nämä jäässä varastoidut kontrollinäytteet ovat avainasemassa arvioitaessa eri tallennuspuskurien suorituskykyä. Osallistujat tuovat näytteet laboratorioomme seuraavan 24 tunnin kuluessa. Laboratorioon vastaanotettuaan kontrollinäytteitä säilytetään -80 °C:ssa, kunnes ne suoritetaan biokemialliseen jatkokäsittelyyn vakiintuneiden protokollien mukaisesti (Gómez-Varela et al., 2023). Loput näytteet säilytetään +20°C:ssa orbital shaker -inkubaattorissa yhteensä 2, 5 ja 10 päivää (simuloiden eri varastointi-/kuljetusaikoja). Näiden ajankohtien päätyttyä näytteet säilytetään -80 °C:ssa, kunnes biokemiallinen jatkokäsittely tapahtuu vakiintuneiden protokollien mukaisesti (Gómez-Varela et al., 2023). Metaproteominen profiilit (osoittaa taksonomiset ja toiminnalliset muutokset suoliston mikrobiomissa ja isännän fysiologiassa; kuten Gomez-Varela, 2023 näistä näytteistä kertovat meille parhaasta säilytysnesteestä (määritelty sellaiseksi, jossa mikrobiomin koostumus ja toiminta ovat enemmän). kuten kontrollinäyte). Tämä koe on välttämätön tutkimuksen vaiheen II käynnistämiseksi, ja se on alalla uutta, koska metaproteomiikan parhaille sisäisille ulostenäytteenottokäytännöille ei ole annettu ohjeita. Rekrytoidaan kuusi tervettä osallistujaa (Systems Biology of Pain -laboratorion jäsenistä, Farmakologian ja toksikologian osasto, Farmaseuttisten tieteiden laitos). Tämä on satunnaistettu tutkimus, jossa ei ole osallistujaryhmiä. Näytteet kerätään kerran ja jaetaan 18 putkeen, jotka edustavat erilaisia ​​olosuhteita. Parhaan säilytysratkaisun löytämiseen riittää 6 koehenkilön näytekoko, ja osallistujat suorittavat näytteenoton kerran normaalin suolen liikkeen alla. Lisäksi osallistujat täyttävät kyselylomakkeen (liitteenä), joka sisältää tiedot, kuten ikä, sukupuoli, painoindeksi, maha-suolikanavan oireiden arviointiasteikko (GSRS), antibioottien antaminen viimeisten 30 päivän aikana ennen näytteenottoa, Bristolin ulostelomake mittakaavassa (BSFS) ja likimääräinen aika, joka tarvitaan näytteen keräämiseen 18 putkessa (hapetusprosessien mahdollisten vaikutusten huomioon ottamiseksi).

Toisessa vaiheessa osallistujien odotetaan keräävän ulostenäytteitä 4 viikon ajan tavanomaisen ulostamisen aikana (enintään kymmenen eri kertaa). Heille toimitetaan riittävä määrä 15 ml:n kartiomaisia ​​sentrifugiputkia (339650, Thermo Scientific), jotka sisältävät parhaiten toimivan säilöntäpuskurin (sellaisena kuin se on määritelty tutkimuksen ensimmäisessä vaiheessa, katso edellä), sekä kaupallinen keräyslaite, jossa on ulosteenkerääjä. . Kun näytteet vastaanotetaan laboratoriossa, niitä säilytetään -80 °C:ssa kunnes biokemiallinen käsittely jatkuu vakiintuneiden protokollien mukaisesti. Lisäksi osallistujat täyttävät kyselylomakkeen (katso yllä). Osallistujat osallistuvat kokeiluun vapaaehtoisesti saatuaan selvityksen kaikista tähän tutkimukseen osallistumisen riskeistä ja eduista sekä allekirjoitettuaan Helsingin julistuksen mukaisen kirjallisen suostumuslomakkeen (ks. suostumuslomake liitteenä). Osallistujia opastetaan ja heille tarjotaan tarvittavat näytteenottolaitteet ulostenäytteiden keräämiseksi (katso yllä) ja näytteen toimittamiseksi farmakologian ja toksikologian laitokselle mahdollisimman pian. Osallistujien odotetaan täyttävän itsetehdyt kyselylomakkeet, jotka sisältävät yllä kuvatun kaltaisia ​​tietoja. Toiseen vaiheeseen rekrytoidaan 46 tervettä osallistujaa (laboratoriomme/osastomme jäsenistä) molemmista sukupuolista (23 miestä ja naista) ottaen huomioon mahdollisen 20 prosentin keskeyttämisprosentin. Tämä on satunnaistettu tutkimus, jossa ei ole osallistujaryhmiä. Otoskoko laskettiin Eggerthella-estimaattien kynnyksen perusteella Kaczmarek et al., 2017 raportoimalla ajalla. Käytetty tilastomenetelmä on F-testi - kaksisuuntainen ANOVA toistuvin mittauksin seuraavilla arvoilla Cohens'd = 0,75, 1-β = 0,80 ja a = 0,05. Odotettavissa on yhteensä 400 - 460 näytettä.

E. Viitteet:

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, J. G., Saake, G., & Heyer, R. (2021). Ulosteen metaproteomiikka paljastaa vähentyneen suolistotulehduksen ja muuttuneen mikrobiaineenvaihdunnan elämäntapojen aiheuttaman painonpudotuksen jälkeen. Biomolecules, 11(5), artikla 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, T. S., Shanahan, F. ja O'Toole, P. W. (2022). Suoliston mikrobiomi terveen ikääntymisen modulaattorina. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, J. R., & Schmidt, M. (2023). Lisääntyy isäntä-mikrobiomivuorovaikutusten taksonominen ja toiminnallinen karakterisointi DIA-PASEF-metaproteomiikalla. Frontiers in Microbiology, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, J. L., Musaad, S. M. ja Holscher, H. D. (2017). Kellonaika ja syömiskäyttäytyminen liittyvät ihmisen maha-suolikanavan mikrobiotan koostumukseen ja toimintaan. The American Journal of Clinical Nutrition, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P. ja Becher, D. (2019). Näytteiden säilytys ja varastointi vaikuttavat merkittävästi taksonomisiin ja toiminnallisiin profiileihin ihmisen suolen mikrobiomin metaproteomiikkatutkimuksissa. Mikro-organismit, 7(9), artikla 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, C. A., Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, R. A., Corthals, G. L., Palva, A., Salonen, A., & de Vos, W. M. (2016). Ulosteen metaproteominen analyysi paljastaa yksilöllisen ja vakaan toiminnallisen mikrobiomin ja probioottisten toimenpiteiden rajoitetut vaikutukset aikuisilla. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, C. I., Raygoza Garay, J. A., Finnicum, C. T., Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Laajamittainen assosiaatioanalyysi tunnistaa isäntätekijät, jotka vaikuttavat ihmisen suoliston mikrobiomin koostumukseen. Nature Genetics, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, R. S., Abu-Ali, G. S., Drew, D. A., Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, A. D., Ivey, K. L., Khalili, H., Brown, G. T., DuLong, C., Song, M., Nguyen, L. H., Mallick, H., Rimm, E. B., Izard, J., Huttenhower, C., & Chan, A. T. (2018). Ihmisen ulosteen mikrobiomin vakaus aikuisten miesten kohortissa. Nature Microbiology, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A. ja Kleiner, M. (2021). Näytteiden säilytys- ja säilytysmenetelmien arviointi suoliston mikrobiomien metaproteomiikka-analyysiä varten. Microbiology Spectrum, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, E. C. (2022). Proteomiikan asema astuessamme 2020-luvulle: Kohti yksilöllistä/tarkkuuslääketiedettä. Analytical Biochemistry, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, D. S., & Taslim, N. A. (2022). Ihmisen toiminta ja muutokset suoliston mikrobiomissa: näkökulma. Human Nutrition & Metabolism, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, S. A., Ning, Z., Starr, A. E., Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A. ja Figeys, D. (2018). Metaproteomiikka paljastaa mikrobiomin ja suoliston ekstrasellulaaristen vesikkeliproteiinien väliset yhteydet lasten tulehduksellisessa suolistosairaudessa. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4