Sonder l'efficacité des tampons de stockage au stade commercial et évaluer la variabilité du métaprotéome intestinal entre les individus (PROTEGI)

A.Introduction :

La métaprotéomique étudie l’ensemble du complément protéique d’une communauté microbienne et offre un aperçu d’écosystèmes complexes comme le microbiome intestinal. La métaprotéomique permet aux chercheurs d’approfondir les microbiomes intestinaux, fournissant ainsi un aperçu de l’abondance et des activités fonctionnelles de ces habitants microbiens. Ces connaissances ont joué un rôle déterminant dans l’élucidation des mécanismes à l’origine de diverses maladies, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin (Zhang et al., 2018) et l’obésité (Biemann et al., 2021). Les chercheurs peuvent développer des stratégies ciblées pour une médecine personnalisée et des soins de santé de précision basées sur la biologie sous-jacente (Nice, 2022) en identifiant les signatures protéiques clés.

Dans les études sur le microbiome intestinal, la collecte et la conservation standardisées d’échantillons sont particulièrement cruciales pour préserver l’intégrité de la communauté microbienne et de son protéome. En effet, pour obtenir des résultats fiables, il faut tenir compte de la sensibilité aux influences environnementales telles que la température et la quantité d'oxygène. Pour les études métaprotéomiques du microbiome intestinal, des méthodes non invasives ou mini-invasives sont préférées pour minimiser les perturbations ou la contamination et préserver la composition microbienne native et les profils protéiques. En outre, les stratégies de manipulation et de stockage des échantillons affectent la dégradation des protéines et la stabilité de la population microbienne. Pour cette raison, une congélation immédiate ou une conservation à basse température (par exemple -80 °C) est souvent recommandée pour maintenir l'intégrité de l'échantillon jusqu'à l'analyse (Hickl et al., 2019). Cependant, le recours à la chaîne du froid pour le stockage et le transport n’est pas compatible avec une stratégie d’échantillonnage sur site nécessaire aux études à grande échelle et délocalisées. De plus, cette solution est moins idéale, plus coûteuse et plus fastidieuse sur le plan logistique que les options potentielles à température ambiante.

De plus, les connaissances actuelles sur les méthodes de collecte/conservation des échantillons fécaux reposent sur la préservation des acides nucléiques ou des métabolites pendant le transport vers le laboratoire pour analyse. Cependant, la préservation des protéines nécessite des stratégies différentes et les études sont rares et reposent sur l’adoption des dispositifs ou réactifs utilisés dans le cas de l’analyse des acides nucléiques ou des métabolites (Mordant & Kleiner, 2021). Ainsi, des protocoles adaptés et standardisés ainsi que la collecte de métadonnées sont essentiels pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des études métaprotéomiques.

La présente étude vise à évaluer l'adéquation de plusieurs tampons commerciaux et non dangereux pour le stockage d'échantillons de selles intestinales humaines au fil du temps. Les échantillons fécaux seront stockés dans cinq tampons différents et seront comparés avec des échantillons directement congelés. En utilisant la métaprotéomique, nous comparerons les identifications protéomiques, taxonomiques et fonctionnelles pour comprendre le potentiel de ces tampons en tant que solution de stockage fiable pour les excréments humains. Cette recherche est unique et, à notre connaissance, aucune étude similaire n’a abordé cette question exigeante.

Des preuves préliminaires chez l’homme ont montré une variabilité inter- et intra-individuelle des protéomes de l’hôte et des microbiomes (Mehta et al., 2018). En particulier, la variation taxonomique et fonctionnelle intra-individuelle du microbiome intestinal semble être inférieure à la variation interindividuelle au fil du temps. Cependant, les profils métatranscriptomiques présentaient une variabilité comparable au sein et entre les sujets. Par conséquent, en utilisant la métaprotéomique, nous visons à évaluer les variabilités inter- et intra-individuelles au niveau du protéome en étudiant des échantillons fécaux collectés périodiquement auprès des participants.

B. La pertinence académique et sociale :

La première partie de l'étude vise à définir le tampon de stockage le plus efficace pour préserver l'intégrité des protéines pendant le transport des échantillons du site de collecte au site de traitement - un facteur clé pour l'avenir de la métaprotéomique appliquée à la santé et aux maladies. Malgré son importance, une évaluation similaire n’a pas été réalisée pour les applications protéomiques. Ces connaissances seront essentielles à des fins académiques pour être utilisées dans des études protéomiques fécales humaines à grande échelle. Pour que les personnes puissent faire examiner leur santé intestinale grâce à la métaprotéomique et libérer le potentiel de la médecine personnalisée et des interventions thérapeutiques basées sur les communautés microbiennes, il sera nécessaire de procéder à une collecte cohérente d'échantillons et cette étude le fournira.

La deuxième partie de l’étude vise à comprendre la variabilité qui peut être observée dans la composition et les fonctions du microbiome intestinal du point de vue protéomique. Le microbiome intestinal est dynamique et est connu pour être modifié par de multiples facteurs tels que l'alimentation (Kolmeder et al., 2016), l'âge (Ghosh et al., 2022), la génétique (Kurilshikov et al., 2021), l'environnement (Nurkolis et al., 2022), etc. Ces variations peuvent être largement classées en inter- et intra-individuelles. La variabilité interindividuelle fait référence aux différences observées entre les individus au sein d'une population ou d'un groupe et peut englober un large éventail de caractéristiques, notamment la constitution génétique, les paramètres physiologiques, les facteurs liés au mode de vie et les expositions environnementales. Comprendre la variabilité interindividuelle des personnes d'une même « communauté » est essentiel dans des domaines tels que la médecine personnalisée, où des interventions adaptées tiennent compte des différences individuelles pour optimiser les résultats du traitement. La variabilité intra-individuelle, quant à elle, fait référence aux variations observées chez un même individu au fil du temps ou dans des conditions différentes et peut résulter de fluctuations biologiques, telles que les rythmes circadiens, les fluctuations hormonales ou les réponses physiologiques à des stimuli. Reconnaître et caractériser la variabilité intra-individuelle est crucial pour interpréter avec précision les résultats de la recherche et évaluer la fiabilité des mesures biologiques, en particulier dans les études longitudinales ou les scénarios de surveillance clinique. Cette étude vise à comprendre ces variabilités grâce aux données protéomiques collectées à partir des échantillons fécaux des participants et à définir les variables détectées dans le microbiome intestinal.

C. Objectifs :

1. Identifier l'effet de cinq tampons différents utilisés pour le stockage et le transport des matières fécales humaines collectées, par profils métaprotéomiques.
2. Déterminer la variabilité du microbiote et des protéomes de l'hôte aux niveaux inter et intra-individuels.

D. Conception de l'étude :

Pour la première phase, nous déploierons le protocole suivant pour l'échantillonnage fécal sur place et la conservation du transport : Les participants (recrutés parmi les membres de notre laboratoire/Division) recevront 18 tubes (numérotés de 1 à 18 ; centrifugeuse conique de 15 ml tubes réf. 339650, Thermo Scientific et 18 écouvillons commerciaux faciles à utiliser (C1052-50, Zymo Research) ou spatules (DNAGenotek). Les 18 tubes correspondent à trois moments de stockage de 6 conditions expérimentales différentes : un tube vide (sans liquide de conservation) comme échantillon témoin et 5 liquides de conservation fécaux non dangereux différents : (a) Tampon interne (appelé LB) avec SDS et urée, obtenue dans le commerce (b) Zymo DNA/RNA Shield (R1100, Zymo Research), (c) tampon Copan Amies (480CE, Copan Italia SpA), (d) OMNIgene•GUT (OM200, DNAGenotek), (e) OMNImet •GUT (ME200, DNAGenotek). En bref, LB, Zymo Shield et OM200 sont connus pour contenir des détergents qui aident à préserver les biomolécules, le tampon Copan Amies est un milieu sans nutriments connu pour maintenir les cellules viables et dont il a été démontré qu'il a des applications en culture, et ME200 est utile à base de solvants. dans les applications métabolomiques. De plus, les participants recevront un récupérateur de selles commercial affiché au-dessus des toilettes pour faciliter l'échantillonnage fécal (Servoprax Stuhlfaenger, numéro de référence H7 61000-50 de www.medundorg.de) et une petite boîte avec des blocs de glace dans laquelle les trois contrôles les échantillons seront stockés et transportés au laboratoire. Ces échantillons de contrôle stockés dans la glace sont essentiels pour évaluer les performances des différents tampons de stockage. Les participants apporteront les échantillons à notre laboratoire dans les 24 heures suivantes. Dès réception au laboratoire, les échantillons de contrôle seront conservés à -80 °C jusqu'à un traitement biochimique ultérieur selon les protocoles établis (Gómez-Varela et al., 2023). Le reste des échantillons sera conservé à +20°C dans un incubateur agitateur orbital pendant un total de 2, 5 et 10 jours (en simulant différentes durées de stockage/transport). À la fin de ces délais, les échantillons seront conservés à -80 °C jusqu'à un traitement biochimique ultérieur selon les protocoles établis (Gómez-Varela et al., 2023). Les profils métaprotéomiques (indiquant les changements taxonomiques et fonctionnels du microbiome intestinal et de la physiologie de l'hôte ; comme dans Gomez-Varela, 2023 à partir de ces échantillons nous informeront sur le meilleur liquide de conservation (défini comme celui où la composition et la fonction du microbiome sont plus comme l'échantillon de contrôle). Cette expérience est nécessaire pour lancer la phase II de l’étude et elle est nouvelle dans le domaine car aucune ligne directrice n’est établie pour les meilleures pratiques internes d’échantillonnage fécal en métaprotéomique. Six participants en bonne santé (parmi les membres du laboratoire de biologie systémique de la douleur, Division de pharmacologie et toxicologie, Département des sciences pharmaceutiques) seront recrutés. Il s'agit d'une étude randomisée sans groupe de participants. Les échantillons seront collectés une fois et distribués dans 18 tubes représentant différentes conditions. Une taille d'échantillon de 6 sujets sera suffisante pour trouver la meilleure solution de conservation et le prélèvement sera effectué une fois sous selles normales par les participants. De plus, les participants rempliront un questionnaire (ci-joint) qui comprend des informations telles que l'âge, le sexe, l'indice de masse corporelle, l'échelle d'évaluation des symptômes gastro-intestinaux (GSRS), l'administration d'antibiotiques au cours des 30 derniers jours précédant le prélèvement de l'échantillon, le formulaire de selles Bristol. (BSFS) et le temps approximatif nécessaire au prélèvement des échantillons dans les 18 tubes (pour tenir compte des effets potentiels dus aux processus d'oxydation).

Pour la deuxième phase, les participants devront collecter des échantillons fécaux pendant 4 semaines au cours de leur défécation régulière (dix fois maximum). Ils recevront un nombre adéquat de tubes à centrifuger coniques de 15 ml (339650, Thermo Scientific) contenant le tampon de conservation le plus performant (tel que défini dans la première phase de l'étude, voir ci-dessus) et un dispositif de collecte commercial avec un récupérateur de selles. . Dès réception au laboratoire, les échantillons seront conservés à -80°C jusqu'à un traitement biochimique ultérieur selon les protocoles établis. De plus, les participants rempliront un questionnaire (voir ci-dessus). Les participants participeront volontairement à l'expérience après avoir reçu une explication de tous les risques et avantages de la participation à la présente étude, et après avoir signé le formulaire de consentement éclairé écrit conformément à la Déclaration d'Helsinki (voir le formulaire de consentement ci-joint). Les participants recevront des instructions et recevront les dispositifs d'échantillonnage nécessaires pour collecter des échantillons de selles (voir ci-dessus) et soumettre les échantillons au Département de pharmacologie et de toxicologie dans les plus brefs délais. Les participants devront remplir des questionnaires auto-administrés contenant des informations comme celle décrite ci-dessus. Pour la deuxième phase, 46 participants sains (parmi les membres de notre laboratoire/Division) seront recrutés des deux sexes (23 hommes et femmes) en considérant un éventuel taux d'abandon de 20 %. Il s'agit d'une étude randomisée sans groupe de participants. La taille de l'échantillon a été calculée sur la base du seuil des estimations d'Eggerthella avec le temps rapporté par Kaczmarek et al., 2017. La procédure statistique utilisée est celle des tests F - ANOVA bidirectionnelle avec mesures répétées avec les valeurs suivantes Cohens'd = 0,75, 1-β= 0,80 et α= 0,05. Au total, entre 400 et 460 échantillons devraient être collectés.

E. Références :

Biemann, R., Buß, E., Benndorf, D., Lehmann, T., Schallert, K., Püttker, S., Reichl, U., Isermann, B., Schneider, JG, Saake, G. et Heyer, R. (2021). La métaprotéomique fécale révèle une inflammation intestinale réduite et une modification du métabolisme microbien suite à une perte de poids induite par le mode de vie. Biomolécules, 11(5), article 5. https://doi.org/10.3390/biom11050726 Ghosh, TS, Shanahan, F. et O'Toole, PW (2022). Le microbiome intestinal comme modulateur du vieillissement en bonne santé. Nature Reviews Gastroentérologie et hépatologie, 19(9), 565-584. https://doi.org/10.1038/s41575-022-00605-x Gómez-Varela, D., Xian, F., Grundtner, S., Sondermann, JR et Schmidt, M. (2023). Caractérisation taxonomique et fonctionnelle croissante des interactions hôte-microbiome par la métaprotéomique DIA-PASEF. Frontières en microbiologie, 14. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1258703 Kaczmarek, JL, Musaad, SM et Holscher, HD (2017). L’heure de la journée et les comportements alimentaires sont associés à la composition et à la fonction du microbiote gastro-intestinal humain. Le Journal américain de nutrition clinique, 106(5), 1220-1231. https://doi.org/10.3945/ajcn.117.156380 Hickl, O., Heintz-Buschart, A., Trautwein-Schult, A., Hercog, R., Bork, P., Wilmes, P. et Becher, D. (2019). La conservation et le stockage des échantillons ont un impact significatif sur les profils taxonomiques et fonctionnels dans les études métaprotéomiques du microbiome intestinal humain. Microorganismes, 7(9), article 9. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090367 Kolmeder, CA, Salojärvi, J., Ritari, J., de Been, M., Raes, J., Falony, G., Vieira-Silva, S., Kekkonen, RA, Corthals, GL, Palva, A., Salonen, A. et de Vos, WM (2016). L'analyse métaprotéomique fécale révèle un microbiome fonctionnel personnalisé et stable et des effets limités d'une intervention probiotique chez les adultes. PloS One, 11(4), e0153294. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153294 Kurilshikov, A., Medina-Gomez, C., Bacigalupe, R., Radjabzadeh, D., Wang, J., Demirkan, A., Le Roy, CI, Raygoza Garay, JA, Finnicum, CT, Liu, X. , Zhernakova, D. V., Bonder, M. J., Hansen, T. H., Frost, F., Rühlemann, M. C., Turpin, W., Moon, J.-Y., Kim, H.-N., Lüll, K., … Zhernakova , A. (2021). Des analyses d'association à grande échelle identifient les facteurs de l'hôte qui influencent la composition du microbiome intestinal humain. Nature Génétique, 53(2), 156-165. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00763-1 Mehta, RS, Abu-Ali, GS, Drew, DA, Lloyd-Price, J., Subramanian, A., Lochhead, P., Joshi, AD, Ivey, KL, Khalili, H., Brown, GT, DuLong, C., Song, M., Nguyen, LH, Mallick, H., Rimm, EB, Izard, J., Huttenhower, C. et Chan, AT (2018). Stabilité du microbiome fécal humain dans une cohorte d'hommes adultes. Microbiologie naturelle, 3(3), 347-355. https://doi.org/10.1038/s41564-017-0096-0 Mordant, A. et Kleiner, M. (2021). Évaluation des méthodes de conservation et de stockage des échantillons pour l'analyse métaprotéomique des microbiomes intestinaux. Spectre de microbiologie, 9(3), e0187721. https://doi.org/10.1128/Spectrum.01877-21 Nice, EC (2022). Le statut de la protéomique à l’aube des années 2020 : vers une médecine personnalisée/de précision. Biochimie analytique, 644, 113840. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113840 Nurkolis, F., Mayulu, N., Yasmine, N., Puspaningtyas, DS et Taslim, NA (2022). Activités humaines et changements dans le microbiome intestinal : une perspective. Nutrition humaine et métabolisme, 30, 200165. https://doi.org/10.1016/j.hnm.2022.200165 Zhang, X., Deeke, SA, Ning, Z., Starr, AE, Butcher, J., Li, J., Mayne, J., Cheng, K., Liao, B., Li, L., Singleton, R., Mack, D., Stintzi, A. et Figeys, D. (2018). La métaprotéomique révèle des associations entre le microbiome et les protéines des vésicules extracellulaires intestinales dans les maladies inflammatoires de l'intestin pédiatriques. Nature Communications, 9(1), 2873. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05357-4