LncRNA ニコチンアミド ヌクレオチド トランスヒドロゲナーゼ アンチセンス RNA1 CRC における NNT-AS1

結腸直腸がん (CRC) は、結腸と直腸に影響を与える不均一な悪性腫瘍です。 これは、3 番目に蔓延し致死率の高い悪性腫瘍であり、2020 年には世界中で約 190 万人の新規感染者が発生し、がん関連死亡のほぼ 9.4% を占めています。 CRC 生存率は主に、診断時の病気の段階に依存します。 したがって、大腸癌の早期発見により、遠隔転移のある後期段階ではわずか 14% であるのに比べ、80 ～ 90% というより高い 5 年生存確率が得られます。 結腸内視鏡検査は大腸がん診断のゴールドスタンダードな方法です。 精度が高いことに加えて、腸穿孔や出血などのかなりの死亡リスクを伴う侵襲的な技術であるため、スクリーニングでの使用は制限されています。 便潜血検査、炭水化物抗原 19-9 (CA19-9) および癌胎児性抗原 (CEA) は、現在利用可能な CRC 早期診断スクリーニング/腫瘍マーカー (TM) 検査です。 CEA および CA19-9 検査はシンプル、非侵襲的、手頃な価格で安全ですが、診断精度には限界があります。 大腸がんのスクリーニングと早期診断は、死亡率を低下させる最も重要な要因であることが確認されています。 200 ヌクレオチドを超える非コード RNA (ncRNA) である長い非コード RNA (lncRNA) は、多くの悪性腫瘍で過剰発現または下方制御され、さまざまな腫瘍の進行に対する潜在的な分子メディエーターとして機能します。 過剰発現した lncRNA は、腫瘍細胞の増殖、アポトーシス、浸潤、転移、オートファジーを増強する癌遺伝子として機能します。 いくつかの lncRNA は、CRC の発生率、転移、および治療抵抗性に関連しています。 最近の研究では、ヒト染色体 5p12 に局在する lncRNA ニコチンアミド ヌクレオチド トランスヒドロゲナーゼ アンチセンス RNA1 (NNT-AS1) が遺伝子発現制御に関与し、乳がん、子宮頸がんなどのさまざまながんにおいて重要な役割を果たしていることが示唆されました。しかしながら、CRCにおけるlncRNA NNT-AS1の役割については、十分な研究が行われていなかった。 マイクロ RNA (miRNA) は、約 22 ヌクレオチドの長さの小さな ncRNA であり、細胞増殖、アポトーシス、血管新生などのさまざまな生物学的機能を担います。 miRNA-5p (ガイド鎖) および -3p 種 (パッセンジャー miRNA) としても知られる成熟 miRNA 種は、前駆体二本鎖の 5' アームと 3' アームの両方に由来する可能性があります。 RNA誘導性サイレンシング複合体にロードされることになっているアームは、ガイド鎖です。 パッセンジャー miRNA は完全に破壊されると考えられていましたが、詳細な配列決定の研究により、特定のマイナー miRNA が保持されており、実際に遺伝子制御において重要な役割を果たしていることが明らかになりました。 多くの研究により、miR の調節不全と腫瘍転移との間に実質的な関連性が見出されています。 ホモ・サピエンス (hsa)-miR-485-5p はヒト染色体 14q32 上に位置しており、下流の細胞増殖および浸潤遺伝子の発現を標的にして制御することにより、いくつかのヒト悪性腫瘍における抗がん/腫瘍抑制遺伝子として同定されています。 CRC における hsa-miR-485-5p の調節機能はまだ不明です。 LncRNAとmiRの相互作用は、さまざまな種類の癌の発生率および/または進行を制御するだけでなく、将来の治療発明の潜在的な標的としても考えられています。 LncRNA NNT-AS1 は、スポンジング hsa-miR-485 を介して胆管癌の増殖、移動、および浸潤を促進することが判明しました。 このスポンジングプロセスは、反応としてβ-カテニンとB細胞慢性リンパ性白血病（CLL）/リンパ腫9（BCL9）を上昇させた。 CRC における LncRNA NNT-AS1 と hsa-miR-485-5p の関係は臨床的にまだ解明されていません。 ほとんどの細胞では、非ストレス環境下では、熱ショックタンパク質 90 (HSP90) は、すべての細胞タンパク質の 1 ～ 2% を構成する高度に保存された分子シャペロンです。 HSP90 タンパク質の重要な機能には、タンパク質のフォールディングと分解が含まれます。 生理学的には、分子シャペロンHSP90AB1と他のコシャペロンとの相互作用は、新たに生成されたタンパク質のフォールディング、またはストレス後の変性タンパク質の安定化と再フォールディングに重要な役割を果たしていますが、病理学的には腫瘍形成に関与しています。 たとえば、骨肉腫内では、hsa-miR-485-5p が 3' に結合します。

-HSP90 メッセンジャー RNA (mRNA) の非翻訳領域 (UTR) は、HSP90 タンパク質の産生を減少させ、それによって腫瘍抑制効果を発揮します。 したがって、CRC患者におけるlncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90軸の臨床的意義を決定するための研究が正当化される。

現在の研究では、健康なエジプト人患者と大腸がんエジプト人患者のコホート末梢血サンプルの両方で、lncRNA NNT-AS1 と hsa-miR-485-5p の血中発現レベル、および HSP90 血清レベルを比較します。 第二に、lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 軸、または個別に調査されたものが、CRC 患者の診断有用性を高めるためにリキッドバイオプシーにおける非侵襲性の分子精度バイオマーカーとして使用されるかどうかを検討します。 また、組織学的グレード 1 ～ 3 による CRC 患者のグループ層別化に基づいています。 最後に、人口統計データまたは臨床病理学的特徴に関連して、CRC エジプト患者のコホートにおける lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 の間の可能性のある関連/相関を軸としてまたは個別に調査します。 すべての発見は、インシリコ手段によっても確認または除外されます。

3.1. 患者グループ 合計 60 人の CRC 患者が研究に登録されました。 CRC患者は、エジプトのカイロにあるカイロ大学国立がん研究所（NCI）の臨床腫瘍クリニックに入院した治療歴のないエジプト人患者のコホートであった。 男性：女性 1：1（30/30）、年齢範囲は 24 ～ 76 歳。

3.2. 対照群は、通常の健康診断検査中または献血中に参加した被験者から無作為に選ばれた、年齢と性別が一致した一見健康なボランティア28名です。 対照群の参加者は薬を服用していないか、病気を患っていませんでした。 コントロールの年齢層は 40 ～ 60 歳、男性と女性の割合は 13:15 です。 患者グループ (n = 60) については、完全な病歴が記録されました。 患者が対象基準を満たし、研究への参加を承認し、インフォームドコンセントに署名した後、診断時に末梢血サンプルが採取されました。 患者が除外基準を満たした場合、血液サンプルは採取されませんでした。 患者の包含基準は、結腸直腸検査のために結腸内視鏡検査ユニットを訪れ、CRCの顕著な症状、便秘、腹痛、直腸出血、および突然の体重減少を含む様々な結腸症状を有する患者であった。 CRC の診断は、結腸内視鏡検査、腹部 X 線画像検査、および病理組織学的検査によって臨床的に確認されました。 患者除外基準には、化学療法、放射線療法、または手術を受けている患者、血液疾患または大腸がん以外のがんを患っている患者が含まれます。 不十分なデータを持つ人や組織病理学的診断が欠落している人、および遠隔転移のある人は研究から除外された。

3.2.1. 患者の病理学的および臨床データ CRC 患者の腫瘍の臨床評価は、カイロ大学のカイロにある NCI 病理学部門で行われました。 患者の結腸直腸手術歴に加えて、すべての CRC 参加者について癌疾患の完全な家族歴が記録されました。 NCI では、CRC の病期分類は、結腸内視鏡検査の結果、腹部 X 線撮影、病理学的分析、および臨床的決定によって決定され、これらの結果と米国癌合同委員会 (AJCC) の 2010 基準に基づいています。 患者は 3 つの段階に分類されます。ステージ I/II: 局所癌、ステージ III: リンパ節 (LN) 局所浸潤 (N1-x)、ステージ IV: 遠隔転移 (M1)。 拡大発生率を伴う LN の関与は、なし (N0) または存在する (N1) として患者ファイルから記録されました。 CRC 患者の家族歴、喫煙状況、糖尿病 (DM) および高血圧 (HTN) などの非感染性疾患の状況が記録されました。 腫瘍部位、腫瘍サイズ、粘液性か否か、リンパ節転移（LNM）、腫瘍浸潤または血管浸潤、腫瘍の分化、腫瘍の悪性度、腫瘍節転移（TNM）の病期分類、炎症性腸疾患（IBD）としての炎症状態、CRC結腸か直腸の場合は位置、横腸、S 状結腸、直腸 S 状結腸、直腸の場合は CRC の臨床症状が、患者のファイルから収集された NCI 生化学分析ユニットまたは統計ユニットによって評価されました。 ヘモグロビン (Hgb)、プロトロンビン時間 (PT)、赤血球沈降速度 (ESR)、血小板数、リンパ球数、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)、C 反応性タンパク質 (CRP) はすべて、カイロの NCI で行われた患者ファイルから記録されました。エジプト、中央臨床生化学研究所 4.2. 血液サンプル ５ミリリットルの末梢静脈血リキッドバイオプシーを、対照およびＣＲＣ患者の肘前静脈から凝固活性化剤ポリマーゲルバキュテナー中に採取した。 完全に凝固したサンプルのバキュテナーを室温 (25 °C) で 4000 rpm で 10 分間遠心分離しました。 収集した血清を等分し、分析まで 3 本の DNase/RNase フリーのエッペンドルフ チューブに入れて -80 °C で保存しました。

4.3. 全 RNA 抽出 手順ガイドラインに従って、血清サンプルから全 RNA を抽出しました。 抽出した RNA を 40 µL の RNase フリー水に溶解し、アリコートに分けて -80 °C で保存しました。

4.4. miRNA を含む精製 RNA の定量 抽出された RNA の純度と濃度は、分光光度計を使用して評価されます。 サンプル中の RNA の量は 260 nm での吸光度 (A260 = 1 → 44 ng/μL) を使用して評価され、RNA 純度は 260/280 nm の比での吸光度を使用して評価されました。

4.5. 定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) を使用した ncRNA の逆転写および発現測定 4.5.1。 lncRNA NNT-AS1 リアルタイム (RT2) First Strand Kit を、メーカーの指示に従って相補 DNA (cDNA) 合成に使用しました。 得られたcDNAは-20℃で保存しました。 逆転写後、qRT-PCR を利用して lncRNA NNT-AS1 の発現を測定し、プライマー RT2 の lncRNA NNT-AS1 の発現レベルを評価しました。 No. 330701）を使用し、ヒト GAPDH の RT2 lncRNA qPCR アッセイ（LPH31725A-200、Cat. No. 330701）を使用してデータを正規化しました。 No. 330701)を内因性対照として使用。 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA合成は手順ガイドラインの指示に従って実施しました。 得られたcDNAは-20℃で保存しました。 逆転写後、qRT-PCR を利用して hsa-miR-485-5p の発現を測定しました。 hsa-miR-485-5p の発現レベルを検出するために、プライマー hsa-hsa-miR-485-5p を使用し、データを正規化した miRNA PCR アッセイ (YP00203901、Cat. No. 339306)を内因性対照として使用。 lncRNA NNT-AS1 および hsa-miR-485 のハウスキーピング遺伝子として GAPDH または SNORD38B (hsa) を使用し、倍率変化としての ncRNA 発現レベルを計算し、倍率変化 (2-ΔΔCt) としてサイクル閾値 (Ct) アプローチを使用して正規化しました。それぞれ-5p。 ΔCtは、それぞれ研究対象のlncRNA NNT-AS1およびhsa-miR-485-5pのCt値からGAPDHおよびSNORD38B(hsa)のCt値を差し引くことによって計算した。

ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ癌サンプル−ΔＣｔ対照サンプル ここで、（ΔＣｔ＝Ｃｔ標的−Ｃｔ基準） ４．５．３． 酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によるＨＳＰ９０タンパク質の定量 市販のキットを製造業者の指示に従って使用し、ＥＬＩＳＡによってＨＳＰ９０を定量した。 ヒト HSP90 アルファ固相サンドイッチ ELISA は、一致する抗体ペア間に結合したターゲットの量を測定します。 付属のマイクロプレートのウェルには、標的特異的抗体がプレコートされています。 これらのウェルでは、サンプル、標準、またはコントロールが固定化 (捕捉) 抗体に結合します。 サンドイッチは、第 2 (検出) 抗体を添加し、続いて酵素、抗体、標的の組み合わせと相互作用して定量可能なシグナルを与える基質溶液を添加することによって構築されます。 この信号の強度は、元の物質内のターゲットの濃度に比例します。

4.5.4. 電気化学発光イムノアッセイによる CEA および CA19-9 の測定 CA19-9 および CEA の血清濃度は、Cobas® e 602 (RocheDiagnostics、North America) を使用する電気化学発光イムノアッセイを使用して測定しました。

4.5.4.1. 定期的な生化学検査。 肝機能検査：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血清アルブミン。 腎機能指標である血清クレアチニンと尿素をすべての参加者について測定しました。

4.5.5. 比率と指数 kg/m2 での体格指数 (BMI) の計算は、標準体重 = 18.5 ～ 24.9 として、すべての参加者に対して行われました。 kg/m2、過体重 = 25-29.9 kg/m2、および肥満 = BMI 30 kg/m2 以上の病的肥満。 血小板対リンパ球比 (PLR) は、免疫応答関連の指標および系統的な炎症バイオマーカーであり、炎症性疾患の重症度との相関において好中球対リンパ球比よりも優れています。