LncRNA Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenase-Antisense RNA1 NNT-AS1 i CRC

Kolorektal kreft (CRC) er en heterogen malignitet som påvirker tykktarmen og endetarmen. Det er den tredje mest utbredte og dødelige maligniteten, med omtrent 1,9 millioner nye tilfeller og nesten 9,4 % av kreftrelaterte dødsfall i 2020 over hele verden. CRC-overlevelsesraten er for det meste avhengig av sykdomsstadiet på diagnosetidspunktet. Dermed gir tidlig påvisning av CRC en høyere 5-års overlevelsessannsynlighet på 80-90 %, sammenlignet med bare 14 % i det sene stadiet med fjernmetastaser. Koloskopi er gullstandardmetoden for CRC-diagnose. Ved siden av dens store nøyaktighet er det en invasiv teknikk med betydelige dødelighetsrisikoer, slik som tarmperforering og blødning, noe som begrenser bruken til screening. Fekal okkult blodprøve, karbohydratantigen 19-9 (CA19-9) og karsinoembryonalt antigen (CEA) er de for øyeblikket tilgjengelige CRC-testene for tidlig diagnosescreening/tumormarkører (TMs). Selv om CEA- og CA19-9-tester er enkle, ikke-invasive, rimelige og trygge, er deres diagnostiske nøyaktighet begrenset. Screening og tidlig diagnose for CRC har blitt identifisert som den viktigste faktoren for å senke dødeligheten. Langt ikke-kodende RNA (lncRNA), som er mer enn 200 nukleotider ikke-kodende RNA (ncRNA), er enten overuttrykt eller nedregulert i en rekke maligniteter, og fungerer som potensielle molekylære mediatorer for progresjon av ulike svulster. Overuttrykte lncRNA-er fungerer som onkogener som forsterker tumorcelleproliferasjon, apoptose, invasjon, metastase og autofagi. Flere lncRNA-er har blitt knyttet til forekomst, metastaser og terapeutisk resistens av CRC. Nyere forskning antydet at lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1 (NNT-AS1), som er lokalisert i det menneskelige kromosomet 5p12, er involvert i genekspresjonsregulering og spiller viktige roller i en rekke kreftformer, som brystkreft, livmorhalskreft. , hepatocellulært karsinom og osteosarkom, ble det imidlertid ikke utført tilstrekkelig forskning om lncRNA NNT-AS1 rolle i CRC. MikroRNA (miRNA) er små ncRNA med ~22 nukleotider lengde, som utfører en rekke biologiske funksjoner som celleproliferasjon, apoptose og angiogenese. De modne miRNA-artene, også kjent som miRNA-5p (guide'-streng) og -3p-arter (passasjer-miRNA), kan stamme fra både 5'- og 3'-armene til forløperdupleksen. Armen som er bestemt til å bli lastet inn i det RNA-induserte lyddempingskomplekset er guidestrengen. Passasjer miRNA-er ble antatt å være fullstendig ødelagt, men dype sekvenseringsundersøkelser har avslørt at visse mindre miRNA-er beholder og faktisk spiller en meningsfull rolle i genregulering. Tallrike studier har funnet en betydelig sammenheng mellom miRs dysregulering og tumormetastase. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p er lokalisert på det humane kromosomet 14q32 og har blitt identifisert som et anticancer/tumor suppressorgen i flere humane maligniteter, gjennom målretting og regulering av uttrykket av nedstrøms celleproliferasjons- og invasjonsgener. Den regulatoriske funksjonen til hsa-miR-485-5p i CRC er fortsatt ubestemt. LncRNAs-miRs-interaksjon vil kontrollere forekomsten og/eller progresjonen av ulike krefttyper, i tillegg til å bli vurdert som potensielt mål for fremtidig behandlingsoppfinnelse. LncRNA NNT-AS1 ble funnet å fremme spredning, migrasjon og invasjon av kolangiokarsinom via sponging av hsa-miR-485. Denne svampeprosessen økte β-catenin og B-celle kronisk lymfatisk leukemi (CLL)/lymfom 9 (BCL9) som respons. LncRNA NNT-AS1s forhold til hsa-miR-485-5p i CRC gjenstår å bestemme klinisk. I de fleste celler, under ikke-stressinnstillinger, er varmesjokkprotein 90 (HSP90) svært bevarte molekylære chaperoner som utgjør 1-2 % av alle cellulære proteiner. Viktige funksjoner til HSP90-proteiner inkluderer proteinfolding og nedbrytning. Fysiologisk spiller den molekylære chaperonen HSP90AB1-interaksjoner med andre co-chaperoner en avgjørende rolle for folding av de nygenererte proteinene eller for å stabilisere og refolde denaturerte proteiner etter stress, men er patologisk involvert i tumorigenese. For eksempel, innenfor osteosarkom, binder hsa-miR-485-5p seg til 3'

-utranslatert region (UTR) av HSP90 messenger RNA (mRNA) for å redusere HSP90 proteinproduksjon, og dermed utøve en tumor suppressor effekt. Derfor er forskning berettiget for å bestemme den kliniske betydningen av lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-aksen hos CRC-pasienter.

Den nåværende studien vil sammenligne blodekspresjonsnivået til lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485-5p, samt HSP90 serumnivåer i både friske og CRC egyptiske pasienters kohort perifere blodprøver. For det andre, undersøk om lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-aksen, eller individuelt undersøkt, vil bli brukt som ikke-invasiv molekylær presisjonsbiomarkør i flytende biopsi for bedre diagnostisk nytte for CRC-pasienter. Også basert på CRC-pasienters gruppestratifisering etter histologiske karakterer 1-3. Til slutt, undersøk den sannsynlige koblingen/korrelasjonen mellom lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 som en akse eller individuelt i CRC egyptiske pasienters kohort i forhold til demografiske data eller klinikopatologiske egenskaper. Alle funn vil også bli bekreftet eller utelukket med in silico-metoder.

3.1. Pasientgruppe Totalt 60 CRC-pasienter ble registrert i studien. CRC-pasienter var behandlingsnaive egyptiske pasienters kohort innlagt på Clinical Oncology Clinic, National Cancer Institute (NCI), Cairo University, Cairo, Egypt. Mann-til-kvinne 1:1 (30/30) og deres aldersgruppe 24-76 år.

3.2. Kontrollgruppe 28 aldersmatchede og kjønnsmatchede tilsynelatende friske frivillige, tilfeldig valgt fra forsøkspersoner som ble vervet under normal kontrollundersøkelse eller under bloddonasjon. Kontrollgruppedeltakerne tok ingen medisiner eller led av noen sykdom. Kontrollens aldersgruppe er 40-60 år og 13:15 mann til kvinne. For pasientgruppen (n = 60) ble en fullstendig historie registrert. Hvis en pasient oppfylte inklusjonskriteriene, og etter å ha gitt sin godkjenning for deltakelse i studien og signert det informerte samtykket, ble det tatt perifere blodprøver ved diagnosetidspunktet. Dersom en pasient oppfylte eksklusjonskriteriene, ble det ikke tatt blodprøver. Pasientens inklusjonskriterier var de som besøkte koloskopienheten for kolorektal undersøkelse og hadde en rekke tykktarmssymptomer, inkludert CRC merkbare symptomer, forstoppelse, magesmerter, rektal blødning og plutselig vekttap. CRC-diagnose ble klinisk bekreftet ved koloskopi, abdominal radio-avbildning og histopatologisk undersøkelse. Ekskluderingskriterier for pasienter inkluderte individer som fikk kjemoterapi, stråling eller gjennomgått kirurgi, pasienter med blodsykdommer eller annen kreft enn CRC. Personer med utilstrekkelige data eller manglende histopatologiske diagnoser, så vel som de med fjernmetastaser, ble ekskludert fra studien.

3.2.1. Pasienter Patologiske og kliniske data Den kliniske vurderingen av CRC-pasients svulst ble gjort ved Patologienheten, NCI, Kairo, Cairo University. I tillegg til en pasienthistorie for kolorektal kirurgi, ble hele familiehistorien med kreftsykdom registrert for alle CRC-deltakere. Ved NCI ble CRC-staging bestemt av koloskopiske resultater, abdominal radiografi, patologiske analyser og kliniske avgjørelser, basert på disse resultatene og American Joint Committee on Cancer (AJCC) kriterier 2010. Pasientene er kategorisert i tre stadier; stadium I/II: lokal kreft, stadium III: lymfeknute (LN) lokalisert involvering (N1-x), og stadium IV: fjernmetastase (M1). LN-involvering med forstørrelsesforekomst som enten ingen (N0) eller tilstede (N1), ble notert fra pasientmapper. CRC-pasientens familiehistorie, røykestatus, status for ikke-smittsomme sykdommer som diabetes mellitus (DM) og hypertensjon (HTN) ble registrert. Tumorsted, tumorstørrelse, mucinøs eller ikke, lymfeknutemetastase (LNM), tumorinvasjon eller vaskulær invasjon, tumordifferensiering, tumorgrad, tumor-node-metastase (TNM) stadieinndeling, inflammasjonsstatus som inflammatorisk tarmsykdom (IBD), CRC plassering hvis tykktarm eller rektal, så vel som om transversale, sigmoid, rectosigmoid og rektale, CRC kliniske symptomer, ble vurdert av NCI Biochemical Analysis Unit eller Statistics Unit, samlet fra pasientfiler. Hemoglobin (Hgb), protrombintid (PT), erytrocyttsedimentasjonshastighet (ESR), antall blodplater, antall lymfocytter, laktatdehydrogenase (LDH), C-reaktivt protein (CRP), ble alle registrert fra pasientfiler utført ved NCI, Kairo Egypt, Central Clinical Biochemistry Lab. 4.2. Blodprøver Fem milliliter væskebiopsi fra perifert veneblod ble samlet fra den antecubitale venen fra kontroller og CRC-pasienter i vakutainere med koagelaktivatorpolymergel. Vacutainere av fullstendig koagulerte prøver ble sentrifugert ved 4000 rpm i 10 minutter ved romtemperatur (25 ◦C). Det oppsamlede serumet ble alikvotert og holdt ved -80 ◦C i tre DNase/RNase-frie Eppendorf-rør frem til analyse.

4.3. Total RNA-ekstraksjon Totalt RNA ble ekstrahert fra serumprøver i henhold til prosedyreretningslinjene. Det ekstraherte RNA ble oppløst i 40 µL RNase-fritt vann og lagret i alikvoter ved -80 ◦C.

4.4. Kvantifisering av renset RNA inkludert miRNA Det ekstraherte RNAs renhet og konsentrasjon vurderes ved bruk av et spektrofotometer. Mengden RNA i prøven ble vurdert ved bruk av absorbans ved 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL), og RNA-renhet ble vurdert ved bruk av absorbans ved 260/280 nm-forhold.

4.5. Revers transkripsjon og ekspresjonsmåling av ncRNA ved bruk av kvantitativ sanntids revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Sanntids (RT2) First Strand Kit ble brukt for komplementær DNA (cDNA) syntese som anvist av produsentens instruksjoner. Det oppnådde cDNA ble lagret ved -20 ◦C. Etter revers transkripsjon ble qRT-PCR brukt for å måle ekspresjonen av lncRNA NNT-AS1 for å evaluere ekspresjonsnivået til lncRNA NNT-AS1, primer RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Kat. nr. 330701) ble brukt, og data ble normalisert ved bruk av RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. nr. 330701) som endogen kontroll. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA-syntese ble utført som anvist av prosedyreretningslinjene. Det oppnådde cDNA ble lagret ved -20 ◦C. Etter revers transkripsjon ble qRT-PCR brukt for å måle ekspresjonen av hsa-miR-485-5p. For å oppdage ekspresjonsnivået til hsa-miR-485-5p, ble primeren hsa-hsa-miR-485-5p brukt og data ble normalisert miRNA PCR-analyse (YP00203901, Cat. nr. 339306) som endogen kontroll. ncRNA-ekspresjonsnivået som fold endring ble beregnet og normalisert ved å bruke syklusterskel (Ct) tilnærmingen som fold endring (2- ΔΔCt) med GAPDH eller SNORD38B (hsa) som husholdningsgenene for lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485 -5p, henholdsvis. ΔCt ble beregnet ved å trekke Ct-verdiene til GAPDH og SNORD38B (hsa) fra de av henholdsvis lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485-5p som ble undersøkt.

ΔΔCt = ΔCt kreftprøver - ΔCt kontrollprøver hvor (ΔCt=Ct mål - Ct referanse) 4.5.3. HSP90-proteinkvantifisering ved Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) HSP90 ble kvantifisert ved ELISA ved å bruke det kommersielt tilgjengelige settet i henhold til produsentens instruksjoner. Human HSP90 alpha solid-fase sandwich ELISA måler mengden mål som er bundet mellom et matchende antistoffpar. I brønnene på den medfølgende mikroplaten er et målspesifikt antistoff forhåndsbelagt. I disse brønnene binder prøver, standarder eller kontroller seg til det immobiliserte (fange) antistoffet. Sandwichen er konstruert ved å tilsette det andre (detektor) antistoffet, etterfulgt av tilsetning av en substratløsning som interagerer med kombinasjonen enzym-antistoff-mål for å gi et kvantifiserbart signal. Dette signalets styrke er proporsjonal med konsentrasjonen av målet i det originale materialet.

4.5.4. CEA- og CA19-9-måling ved elektrokjemiluminescens-immunoanalyse CA19-9- og CEA-serumkonsentrasjoner ble målt ved bruk av en elektrokjemiluminescensimmunanalyse ved bruk av Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Nord-Amerika.

4.5.4.1. Rutinemessig biokjemisk testing. Leverfunksjonstester: alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST) og serumalbumin. Nyrefunksjonsindikatorer serumkreatinin og urea ble bestemt for alle deltakerne.

4.5.5. Forhold og indekser Kroppsmasseindeks (BMI) beregning i kg/m2 ble gjort for alle deltakerne, der normalvekt = 18,5-24,9 kg/m2, overvekt = 25-29,9 kg/m2, og fedme = BMI på 30 kg/m2 eller høyere sykelig overvekt. Blodplate-til-lymfocytter-forholdet (PLR) er en immunresponsrelatert indikator og systematisk inflammasjonsbiomarkør, som er overlegen nøytrofil-til-lymfocytter-forholdet for korrelasjon med alvorlighetsgraden av inflammatorisk sykdom.