LncRNA Transhydrogenaza nukleotydowa nikotynamidu - antysensowny RNA1 NNT-AS1 w CRC

Rak jelita grubego (CRC) to heterogenny nowotwór złośliwy atakujący okrężnicę i odbytnicę. Jest to trzeci pod względem rozpowszechnienia i śmiertelności nowotwór złośliwy, z około 1,9 mln nowych przypadków i prawie 9,4% zgonów spowodowanych nowotworami w 2020 r. na całym świecie. Wskaźnik przeżycia CRC zależy głównie od stadium choroby w momencie rozpoznania. Zatem wczesne wykrycie CRC zapewnia wyższe prawdopodobieństwo przeżycia 5-letniego wynoszące 80–90% w porównaniu z zaledwie 14% w późnym stadium z odległymi przerzutami. Kolonoskopia jest złotym standardem w diagnostyce CRC. Oprócz dużej dokładności jest to technika inwazyjna, obarczona znacznym ryzykiem śmiertelności, np. perforacją i krwawieniem jelit, co ogranicza jej zastosowanie w badaniach przesiewowych. Badanie na krew utajoną w kale, antygen węglowodanowy 19-9 (CA19-9) i antygen rakowo-embrionalny (CEA) to obecnie dostępne badania przesiewowe/markery nowotworowe (TM) wczesnej diagnostyki CRC. Chociaż testy CEA i CA19-9 są proste, nieinwazyjne, niedrogie i bezpieczne, ich dokładność diagnostyczna jest ograniczona. Badania przesiewowe i wczesna diagnostyka CRC uznano za najważniejszy czynnik obniżający śmiertelność. Długie niekodujące RNA (lncRNA), które składają się z ponad 200 nukleotydów niekodujących RNA (ncRNA), ulegają nadekspresji lub obniżeniu w wielu nowotworach złośliwych i działają jako potencjalne molekularne mediatory progresji różnych nowotworów. Nadeksprymowane lncRNA działają jako onkogeny zwiększające proliferację komórek nowotworowych, apoptozę, inwazję, przerzuty i autofagię. Kilka lncRNA powiązano z występowaniem, przerzutami i opornością terapeutyczną CRC. Ostatnie badania sugerują, że lncRNA antysensowny RNA1 transhydrogenazy nikotynamidowej nukleotydu (NNT-AS1), zlokalizowany w ludzkim chromosomie 5p12, bierze udział w regulacji ekspresji genów i odgrywa ważną rolę w różnych nowotworach, takich jak rak piersi, rak szyjki macicy , raka wątrobowokomórkowego i kostniakomięsaka, jednak nie przeprowadzono wystarczających badań na temat roli lncRNA NNT-AS1 w CRC. MikroRNA (miRNA) to małe ncRNA o długości ~22 nukleotydów, które pełnią różnorodne funkcje biologiczne, takie jak proliferacja komórek, apoptoza i angiogeneza. Dojrzałe gatunki miRNA, znane również jako miRNA-5p (nić prowadząca) i gatunki -3p (miRNA pasażerskie), mogą pochodzić zarówno z ramion 5', jak i 3' dupleksu prekursora. Ramię przeznaczone do załadowania do kompleksu wyciszającego indukowanego RNA jest nicią prowadzącą. Zakładano, że miRNA pasażerów zostały całkowicie zniszczone, jednakże głębokie badania sekwencjonowania wykazały, że pewne mniejsze miRNA zachowują się i w rzeczywistości odgrywają znaczącą rolę w regulacji genów. Liczne badania wykazały istotny związek między rozregulowaniem miR a przerzutami nowotworu. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p znajduje się na ludzkim chromosomie 14q32 i został zidentyfikowany jako gen przeciwnowotworowy/supresyjny w przypadku kilku ludzkich nowotworów złośliwych poprzez celowanie i regulację ekspresji dalszych genów proliferacji i inwazji komórek. Funkcja regulacyjna hsa-miR-485-5p w CRC jest nadal nieokreślona. Interakcja LncRNA-miR kontrolowałaby częstość występowania i/lub progresję różnych typów nowotworów, a także byłaby uważana za potencjalny cel przyszłego wynalazku terapeutycznego. Stwierdzono, że LncRNA NNT-AS1 sprzyja proliferacji, migracji i inwazji raka dróg żółciowych poprzez gąbczasty hsa-miR-485. W odpowiedzi na ten proces gąbkowania podwyższono poziom β-kateniny i przewlekłej białaczki limfatycznej (CLL)/chłoniaka 9 (BCL9) z komórek B. Związek LncRNA NNT-AS1 z hsa-miR-485-5p w CRC pozostaje do ustalenia klinicznego. W większości komórek, w warunkach bezstresowych, białko szoku cieplnego 90 (HSP90) to wysoce konserwatywne molekularne białka opiekuńcze, które stanowią 1-2% wszystkich białek komórkowych. Do ważnych funkcji białek HSP90 należy zwijanie i degradacja białek. Z fizjologicznego punktu widzenia interakcje molekularnego białka opiekuńczego HSP90AB1 z innymi białkami opiekuńczymi odgrywają kluczową rolę w fałdowaniu nowo wygenerowanych białek lub w stabilizowaniu i ponownym fałdowaniu zdenaturowanych białek po stresie, ale patologicznie biorą udział w powstawaniu nowotworów. Na przykład w obrębie kostniakomięsaka hsa-miR-485-5p wiąże się z końcem 3'

-nieulegający translacji region (UTR) informacyjnego RNA (mRNA) HSP90 w celu zmniejszenia wytwarzania białka HSP90, a tym samym wywierania efektu supresorowego nowotworu. Dlatego uzasadnione są badania mające na celu określenie znaczenia klinicznego osi lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 u pacjentów z CRC.

Obecne badanie porówna poziom ekspresji lncRNA NNT-AS1 i hsa-miR-485-5p, a także poziomy HSP90 w surowicy zarówno w próbkach krwi obwodowej zdrowych, jak i kohortowych egipskich pacjentów z CRC. Po drugie, należy zbadać, czy oś lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 lub badana indywidualnie, mogłaby zostać zastosowana jako nieinwazyjny biomarker o precyzji molekularnej w biopsji płynnej w celu uzyskania lepszej przydatności diagnostycznej u pacjentów z CRC. Ponadto na podstawie stratyfikacji grup pacjentów z CRC według stopnia histologicznego 1-3. Na koniec zbadaj prawdopodobne powiązanie/korelację między lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 jako osią lub indywidualnie w kohorcie egipskich pacjentów z CRC w odniesieniu do danych demograficznych lub cech kliniczno-patologicznych. Wszystkie ustalenia zostaną potwierdzone lub wykluczone również za pomocą metod in silico.

3.1. Grupa pacjentów Do badania włączono ogółem 60 pacjentów z CRC. Pacjenci z CRC to nieleczeni pacjenci z Egiptu, przyjęci do Kliniki Onkologii Klinicznej Narodowego Instytutu Raka (NCI) Uniwersytetu w Kairze w Kairze, Egipt. Mężczyzna do kobiety 1:1 (30/30) i ich przedział wiekowy 24–76 lat.

3.2. Grupa kontrolna 28 pozornie zdrowych ochotników dobranych pod względem wieku i płci, wybranych losowo spośród osób zapisanych podczas normalnego badania kontrolnego lub podczas oddawania krwi. Uczestnicy grupy kontrolnej nie przyjmowali żadnych leków ani nie cierpieli na żadną chorobę. Przedział wiekowy grupy kontrolnej to 40–60 lat i 13:15 w przypadku mężczyzn i kobiet. Dla grupy pacjentów (n = 60) zebrano pełny wywiad. Jeżeli pacjent spełniał kryteria włączenia i po wyrażeniu zgody na udział w badaniu oraz podpisaniu świadomej zgody, w chwili rozpoznania pobierano próbki krwi obwodowej. Jeżeli pacjent spełniał kryteria wykluczenia, nie pobierano próbek krwi. Kryteriami włączenia do badania byli pacjenci, którzy odwiedzili Oddział Kolonoskopii w celu wykonania badania jelita grubego i mieli różnorodne objawy ze strony jelita grubego, w tym zauważalne objawy CRC, zaparcia, bóle brzucha, krwawienie z odbytu i nagłą utratę masy ciała. Rozpoznanie CRC potwierdzono klinicznie na podstawie kolonoskopii, radiogramów jamy brzusznej i badania histopatologicznego. Kryteria wykluczenia pacjentów obejmowały osoby otrzymujące chemioterapię, radioterapię lub poddane operacji, pacjenci z chorobami krwi lub jakimkolwiek nowotworem innym niż CRC. Z badania wykluczono osoby posiadające niewystarczające dane lub brak rozpoznania histopatologicznego, a także osoby z przerzutami odległymi.

3.2.1. Dane patologiczne i kliniczne pacjentów Kliniczną ocenę nowotworu u pacjentów z CRC przeprowadzono w Oddziale Patologii, NCI, Kair, Uniwersytet w Kairze. Oprócz historii operacji jelita grubego u wszystkich uczestników CRC zarejestrowano pełną historię chorób nowotworowych w rodzinie. W NCI stopień zaawansowania CRC określono na podstawie wyników kolonoskopii, radiografii jamy brzusznej, analiz patologicznych i decyzji klinicznych, opierając się na tych wynikach i kryteriach Amerykańskiego Wspólnego Komitetu ds. Raka (AJCC) z 2010 r. Pacjenci są podzieleni na trzy etapy; stopień I/II: rak miejscowy, stopień III: zajęcie węzłów chłonnych (LN) zlokalizowane (N1-x) i stopień IV: przerzuty odległe (M1). W kartotece pacjentów odnotowano występowanie zajęcia LN z występowaniem powiększenia jako brak (N0) lub obecne (N1). Rejestrowano wywiad rodzinny pacjentów z CRC, palenie tytoniu, status chorób niezakaźnych, takich jak cukrzyca (DM) i nadciśnienie (HTN). Lokalizacja guza, wielkość guza, śluzowy lub nie, przerzuty do węzłów chłonnych (LNM), naciekanie guza lub naciekanie naczyń, różnicowanie guza, stopień guza, stopień zaawansowania nowotworu i przerzutów do węzłów chłonnych (TNM), stan zapalny jako choroba zapalna jelit (IBD), CRC lokalizacja, jeśli objawy kliniczne CRC występują w okrężnicy lub odbytnicy, a także w przypadku objawów klinicznych CRC poprzecznych, esicy, odbytnicy i odbytnicy, oceniała Jednostka Analiz Biochemicznych NCI lub Jednostka Statystyczna zebrana z dokumentacji pacjentów. Z kartoteki pacjentów sporządzonej w NCI w Kairze rejestrowano hemoglobinę (Hgb), czas protrombinowy (PT), szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR), liczbę płytek krwi, liczbę limfocytów, dehydrogenazę mleczanową (LDH), białko C-reaktywne (CRP). Egipt, Centralne Laboratorium Biochemii Klinicznej. 4.2. Próbki krwi Pięć mililitrów płynnej biopsji krwi żylnej obwodowej pobrano z żyły łokciowej od grupy kontrolnej i pacjentów z CRC do próżniowych pojemników z żelem polimerowym aktywującym skrzep. Pojemniki próżniowe z całkowicie skoagulowanymi próbkami wirowano przy 4000 obr/min przez 10 minut w temperaturze pokojowej (25°C). Zebraną surowicę podzielono na porcje i trzymano w temperaturze -80°C w trzech probówkach Eppendorfa wolnych od DNazy/RNazy do czasu analizy.

4.3. Ekstrakcja całkowitego RNA Całkowity RNA ekstrahowano z próbek surowicy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi procedury. Wyekstrahowany RNA rozpuszczono w 40 µl wody wolnej od RNazy i przechowywano w porcjach w temperaturze -80°C.

4.4. Ocena ilościowa oczyszczonego RNA, w tym miRNA. Czystość i stężenie wyekstrahowanego RNA ocenia się za pomocą spektrofotometru. Ilość RNA w próbce oceniano za pomocą absorbancji przy 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL), a czystość RNA oceniano za pomocą absorbancji przy stosunku 260/280 nm.

4,5. Pomiar odwrotnej transkrypcji i ekspresji ncRNA przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Zestaw pierwszej nici czasu rzeczywistego (RT2) użyto do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) zgodnie z instrukcjami producenta. Otrzymany cDNA przechowywano w temperaturze -20°C. Po odwrotnej transkrypcji zastosowano qRT-PCR do pomiaru ekspresji lncRNA NNT-AS1 w celu oceny poziomu ekspresji lncRNA NNT-AS1, startera RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, nr kat. nr 330701), a dane normalizowano przy użyciu testu RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. nr 330701) jako kontrola endogenna. 4.5.2. Syntezę cDNA hsa-miR-485-5p przeprowadzono zgodnie z wytycznymi procedury. Otrzymany cDNA przechowywano w temperaturze -20°C. Po odwrotnej transkrypcji zastosowano qRT-PCR do pomiaru ekspresji hsa-miR-485-5p. Aby wykryć poziom ekspresji hsa-miR-485-5p, zastosowano starter hsa-hsa-miR-485-5p, a dane znormalizowano w teście PCR miRNA (YP00203901, nr kat. nr 339306) jako kontrola endogenna. Poziom ekspresji ncRNA jako krotność zmiany obliczono i znormalizowano przy użyciu podejścia z progiem cyklu (Ct) jako krotności zmiany (2-ΔΔCt) z GAPDH lub SNORD38B (hsa) jako genami porządkowymi dla lncRNA NNT-AS1 i hsa-miR-485 -5p, odpowiednio. ΔCt obliczono poprzez odjęcie wartości Ct GAPDH i SNORD38B (hsa) od wartości odpowiednio badanego lncRNA NNT-AS1 i hsa-miR-485-5p.

ΔΔCt = ΔCt próbki nowotworu – ΔCt próbki kontrolne gdzie (ΔCt=Ct docelowy – Ct odniesienie) 4.5.3. Oznaczanie ilościowe białka HSP90 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) HSP90 oznaczano ilościowo za pomocą testu ELISA przy użyciu dostępnego w handlu zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Test kanapkowy ELISA w fazie stałej ludzkiego HSP90 alfa mierzy ilość celu związanego pomiędzy pasującą parą przeciwciał. Dołki dostarczonej mikropłytki zostały wstępnie pokryte przeciwciałem specyficznym dla obiektu docelowego. W tych dołkach próbki, standardy lub kontrole wiążą się z unieruchomionym (wychwytującym) przeciwciałem. Kanapkę konstruuje się przez dodanie drugiego przeciwciała (detektorowego), a następnie dodanie roztworu substratu, który oddziałuje z kombinacją enzym-przeciwciało-cel, dając wymierny sygnał. Siła tego sygnału jest proporcjonalna do stężenia celu w materiale oryginalnym.

4.5.4. Pomiar CEA i CA19-9 za pomocą testu immunologicznego elektrochemiluminescencji. Stężenia CA19-9 i CEA w surowicy mierzono za pomocą testu immunologicznego elektrochemiluminescencji przy użyciu Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Ameryka Północna.

4.5.4.1. Rutynowe badania biochemiczne. Testy czynności wątroby: aminotransferaza alaninowa (ALT), aminotransferaza asparaginianowa (AST) i albumina surowicy. U wszystkich uczestników oznaczono wskaźniki czynności nerek w surowicy, kreatyninę i mocznik.

4.5.5. Wskaźniki i wskaźniki Obliczenia wskaźnika masy ciała (BMI) w kg/m2 dokonano dla wszystkich uczestników, dla których prawidłowa masa ciała = 18,5-24,9 kg/m2, nadwaga = 25-29,9 kg/m2 i otyłość = BMI 30 kg/m2 lub większe, chorobliwa otyłość. Stosunek płytek do limfocytów (PLR) jest wskaźnikiem związanym z odpowiedzią immunologiczną i biomarkerem systematycznego zapalenia, który jest lepszy od stosunku neutrofili do limfocytów pod względem korelacji z ciężkością choroby zapalnej.