LncRNA никотинамидный нуклеотид, трансгидрогеназа, антисмысловая РНК1, NNT-AS1 при КРР

Колоректальный рак (КРР) — гетерогенное злокачественное новообразование, поражающее ободочную и прямую кишку. Это третье по распространенности и летальному исходу злокачественное новообразование: в 2020 году во всем мире будет зарегистрировано около 1,9 миллиона новых случаев и почти 9,4% смертей, связанных с раком. Выживаемость при КРР в основном зависит от стадии заболевания на момент постановки диагноза. Таким образом, раннее выявление КРР обеспечивает более высокую 5-летнюю вероятность выживаемости – 80–90% по сравнению со всего лишь 14% на поздней стадии с отдаленными метастазами. Колоноскопия является золотым стандартом диагностики колоректального рака. Помимо высокой точности, это инвазивный метод со значительным риском смертности, например, перфорацией кишечника и кровотечением, что ограничивает его использование для скрининга. Анализ кала на скрытую кровь, углеводный антиген 19-9 (CA19-9) и карциноэмбриональный антиген (CEA) являются в настоящее время доступными тестами для ранней диагностики колоректального рака/опухолевых маркеров (TM). Хотя тесты CEA и CA19-9 просты, неинвазивны, доступны по цене и безопасны, их диагностическая точность ограничена. Скрининг и ранняя диагностика КРР были определены как наиболее значимый фактор снижения смертности. Длинные некодирующие РНК (днРНК), которые представляют собой некодирующие РНК (нкРНК) длиной более 200 нуклеотидов, либо сверхэкспрессируются, либо подавляются при многих злокачественных новообразованиях и действуют как потенциальные молекулярные медиаторы для прогрессирования различных опухолей. Сверхэкспрессированные днРНК действуют как онкогены, усиливая пролиферацию опухолевых клеток, апоптоз, инвазию, метастазирование и аутофагию. Некоторые днРНК связаны с заболеваемостью, метастазированием и терапевтической резистентностью КРР. Недавние исследования показали, что днРНК никотинамид-нуклеотид-антисмысловая трансгидрогеназа РНК1 (NNT-AS1), которая локализована в хромосоме человека 5p12, участвует в регуляции экспрессии генов и играет важную роль при различных видах рака, таких как рак молочной железы, рак шейки матки. , гепатоцеллюлярной карциноме и остеосаркоме, однако недостаточно исследований роли днРНК NNT-AS1 в CRC. МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие нкРНК длиной ~22 нуклеотида, которые выполняют множество биологических функций, таких как пролиферация клеток, апоптоз и ангиогенез. Зрелые виды микроРНК, также известные как виды микроРНК-5p (направляющая цепь) и виды -3p (миРНК-пассажир), могут происходить как из 5'-, так и из 3'-плечей дуплекса-предшественника. Плечо, которое предназначено для загрузки в РНК-индуцируемый комплекс молчания, является направляющей цепью. Предполагалось, что микроРНК-пассажиры полностью уничтожены, однако исследования глубокого секвенирования показали, что некоторые минорные микроРНК сохраняются и фактически играют значимую роль в регуляции генов. Многочисленные исследования обнаружили существенную связь между нарушением регуляции миР и метастазированием опухоли. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p расположен на хромосоме 14q32 человека и был идентифицирован как ген-супрессор противорака/опухоля при нескольких злокачественных новообразованиях человека посредством нацеливания и регуляции экспрессии нижестоящих генов пролиферации и инвазии клеток. Регуляторная функция hsa-miR-485-5p при КРР до сих пор не определена. Взаимодействие LncRNAs-miR будет контролировать заболеваемость и/или прогрессирование различных типов рака, а также рассматриваться как потенциальная мишень для будущих изобретений в области лечения. Было обнаружено, что LncRNA NNT-AS1 способствует пролиферации, миграции и инвазии холангиокарциномы посредством спонжирования hsa-miR-485. В ответ этот губчатый процесс повышал уровень β-катенина и В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ)/лимфомы 9 (BCL9). Связь LncRNA NNT-AS1 с hsa-miR-485-5p при CRC еще предстоит определить клинически. В большинстве клеток в условиях отсутствия стресса белок теплового шока 90 (HSP90) представляет собой высококонсервативные молекулярные шапероны, составляющие 1–2% всех клеточных белков. Важные функции белков HSP90 включают сворачивание и деградацию белков. Физиологически взаимодействия молекулярного шаперона HSP90AB1 с другими ко-шаперонами играют решающую роль в сворачивании вновь генерируемых белков или в стабилизации и рефолдинге денатурированных белков после стресса, но патологически участвуют в онкогенезе. Например, при остеосаркоме hsa-миР-485-5p связывается с 3'-концом.

-нетранслируемая область (UTR) информационной РНК (мРНК) HSP90 для снижения выработки белка HSP90, тем самым оказывая эффект супрессора опухоли. Таким образом, необходимы исследования для определения клинического значения оси lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 у пациентов с CRC.

В текущем исследовании будет сравниваться уровень экспрессии в крови lncRNA NNT-AS1 и hsa-miR-485-5p, а также уровни HSP90 в сыворотке как в образцах периферической крови здоровых пациентов, так и египетских пациентов с КРР. Во-вторых, выясните, будет ли ось lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 использоваться или индивидуально исследоваться в качестве неинвазивного биомаркера молекулярной точности при жидкой биопсии для повышения диагностической эффективности у пациентов с CRC. Также на основе групповой стратификации пациентов с КРР по гистологическим классам 1-3. Наконец, исследуйте возможную связь/корреляцию между lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 как по оси, так и индивидуально в когорте египетских пациентов с CRC в отношении демографических данных или клинико-патологических характеристик. Все результаты также будут подтверждены или опровергнуты методами in silico.

3.1. Группа пациентов В исследовании приняли участие в общей сложности 60 пациентов с КРР. Пациенты с КРР представляли собой группу египетских пациентов, ранее не получавших лечения, поступивших в клинику клинической онкологии Национального института рака (NCI) Каирского университета, Каир, Египет. Соотношение мужчин и женщин 1:1 (30/30) и возрастной диапазон 24–76 лет.

3.2. Контрольная группа состояла из 28 практически здоровых добровольцев соответствующего возраста и пола, случайно выбранных из числа субъектов, включенных в список во время обычного осмотра или во время сдачи крови. Участники контрольной группы не принимали никаких лекарств и не страдали какими-либо заболеваниями. Возрастной диапазон контрольной группы составляет 40–60 лет и соотношение мужчин и женщин 13:15. Для группы пациентов (n = 60) был записан полный анамнез. Если пациент соответствовал критериям включения и после получения согласия на участие в исследовании и подписания информированного согласия, во время постановки диагноза брали образцы периферической крови. Если пациент соответствовал критериям исключения, образцы крови не брали. Критериями включения пациентов были те, кто посетил отделение колоноскопии для колоректального обследования и имел различные симптомы толстой кишки, включая заметные симптомы колоректального рака, запор, боль в животе, ректальное кровотечение и внезапную потерю веса. Диагноз КРР был клинически подтвержден данными колоноскопии, рентгенографии брюшной полости и гистопатологического исследования. Критерии исключения пациентов включали лиц, получавших химиотерапию, лучевую терапию или перенесших хирургическое вмешательство, пациентов с заболеваниями крови или любым раком, кроме КРР. Из исследования были исключены лица с недостаточными данными или отсутствующим гистопатологическим диагнозом, а также лица с отдаленными метастазами.

3.2.1. Патологические и клинические данные пациентов. Клиническая оценка опухоли пациентов с КРР проводилась в отделении патологии Национального института онкологии Каира, Каирского университета. В дополнение к истории колоректальных операций у всех участников CRC была записана полная семейная история раковых заболеваний. В NCI стадия КРР определялась на основании результатов колоноскопии, рентгенографии брюшной полости, патологических анализов и клинических решений на основе этих результатов и критериев Американского объединенного комитета по раку (AJCC) 2010 года. Пациенты делятся на три стадии; стадия I/II: локальный рак, стадия III: локализованное поражение лимфатических узлов (LN) (N1-x) и стадия IV: отдаленные метастазы (M1). В файлах пациентов отмечалось поражение ЛУ с частотой увеличения как отсутствие (N0), так и наличие (N1). У больных КРР регистрировали семейный анамнез, статус курения, статус таких неинфекционных заболеваний, как сахарный диабет (СД) и артериальная гипертензия (АГ). Местоположение опухоли, размер опухоли, муцинозный или нет, метастазы в лимфатические узлы (LNM), опухолевая инвазия или сосудистая инвазия, дифференцировка опухоли, степень опухоли, стадия метастазирования опухолевых узлов (TNM), статус воспаления как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), КРР Местоположение, если клинические симптомы колоректального рака толстой или прямой кишки, а также поперечные, сигмовидные, ректосигмовидные и ректальные, оценивались отделом биохимического анализа или статистическим отделом NCI, собранными из файлов пациентов. Гемоглобин (Hgb), протромбиновое время (ПВ), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), количество тромбоцитов, количество лимфоцитов, лактатдегидрогеназа (ЛДГ), С-реактивный белок (СРБ) - все были записаны из карт пациентов, сделанных в NCI, Каир. Египет, Центральная лаборатория клинической биохимии. 4.2. Образцы крови Пять миллилитров жидкой биопсии периферической венозной крови были собраны из локтевой вены у контрольной группы и пациентов с КРР в вакутейнеры с полимерным гелем активатора свертывания крови. Вакутейнеры с полностью коагулированными образцами центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре (25 ◦С). Собранную сыворотку разделяли на аликвоты и хранили при температуре -80°С в трех пробирках Эппендорфа, не содержащих ДНКазы/РНКазы, до проведения анализа.

4.3. Экстракция тотальной РНК. Тотальную РНК экстрагировали из образцов сыворотки в соответствии с инструкциями по процедуре. Экстрагированную РНК растворяли в 40 мкл воды, свободной от РНКазы, и хранили в аликвотах при температуре - 80 ◦C.

4.4. Количественное определение очищенной РНК, включая микроРНК. Чистоту и концентрацию выделенной РНК оценивают с помощью спектрофотометра. Количество РНК в образце оценивали по оптической плотности при 260 нм (A260 = 1 → 44 нг/мкл), а чистоту РНК оценивали по оптической плотности при соотношении 260/280 нм.

4.5. Обратная транскрипция и измерение экспрессии нкРНК с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Набор First Strand Kit реального времени (RT2) использовали для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную кДНК хранили при температуре - 20 ◦С. После обратной транскрипции использовали qRT-PCR для измерения экспрессии днРНК NNT-AS1 для оценки уровня экспрессии lncRNA NNT-AS1, анализа qPCR праймера RT2 lncRNA для человеческого NNT-AS1 (LPH15988A-200, кат. № 330701), и данные нормализовали с помощью кПЦР-анализа днРНК RT2 на ГАФД человека (LPH31725A-200, кат. №330701) в качестве эндогенного контроля. 4.5.2. Синтез кДНК hsa-miR-485-5p осуществляли в соответствии с инструкциями по методике. Полученную кДНК хранили при температуре - 20 ◦С. После обратной транскрипции для измерения экспрессии hsa-миР-485-5p использовали qRT-PCR. Для определения уровня экспрессии hsa-miR-485-5p использовали праймер hsa-hsa-miR-485-5p и данные нормализовали с помощью ПЦР-анализа микроРНК (YP00203901, кат. №339306) в качестве эндогенного контроля. Уровень экспрессии нкРНК как кратное изменение рассчитывали и нормализовали с использованием подхода порога цикла (Ct) как кратного изменения (2-ΔΔCt) с GAPDH или SNORD38B (hsa) в качестве генов домашнего хозяйства для lncRNA NNT-AS1 и hsa-miR-485. -5р соответственно. ΔCt рассчитывали путем вычитания значений Ct GAPDH и SNORD38B (hsa) из значений исследуемых днРНК NNT-AS1 и hsa-miR-485-5p соответственно.

ΔΔCt = ΔCt раковые образцы - ΔCt контрольные образцы, где (ΔCt = целевой Ct - эталонный Ct) 4.5.3. Количественное определение белка HSP90 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Количественное определение HSP90 проводили с помощью ELISA с использованием коммерчески доступного набора в соответствии с инструкциями производителя. Твердофазный сэндвич-ИФА HSP90 альфа человека измеряет количество мишени, связанной между совпадающей парой антител. В лунки прилагаемого микропланшета предварительно нанесено антитело, специфичное к мишени. В этих лунках образцы, стандарты или контроли связываются с иммобилизованным (захватывающим) антителом. Сэндвич создается путем добавления второго (детекторного) антитела с последующим добавлением раствора субстрата, который взаимодействует с комбинацией фермент-антитело-мишень, давая поддающийся количественной оценке сигнал. Сила этого сигнала пропорциональна концентрации мишени в исходном материале.

4.5.4. Измерение CEA и CA19-9 с помощью электрохемилюминесцентного иммуноанализа. Концентрации CA19-9 и CEA в сыворотке измеряли с использованием электрохемилюминесцентного иммуноанализа с использованием Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Северная Америка.

4.5.4.1. Рутинные биохимические исследования. Функциональные пробы печени: аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ) и сывороточный альбумин. У всех участников определяли показатели функции почек сывороточного креатинина и мочевины.

4.5.5. Соотношения и индексы. Расчет индекса массы тела (ИМТ) в кг/м2 проводился для всех участников, где нормальный вес = 18,5-24,9. кг/м2, перевес = 25-29,9 кг/м2, а ожирение = ИМТ 30 кг/м2 или более болезненное ожирение. Отношение тромбоцитов к лимфоцитам (PLR) является показателем, связанным с иммунным ответом, и систематическим биомаркером воспаления, который превосходит соотношение нейтрофилов и лимфоцитов по корреляции с тяжестью воспалительного заболевания.