LncRNA Nicotinamide Nucleotide Transidrogenasi-Antisenso RNA1 NNT-AS1 nel CRC

Il cancro del colon-retto (CRC) è una neoplasia eterogenea che colpisce il colon e il retto. È la terza neoplasia maligna più diffusa e letale, con circa 1,9 milioni di nuovi casi e quasi il 9,4% dei decessi correlati al cancro nel 2020 in tutto il mondo. Il tasso di sopravvivenza del CRC dipende principalmente dallo stadio della malattia al momento della diagnosi. Pertanto, la diagnosi precoce del CRC fornisce una probabilità di sopravvivenza a 5 anni più elevata dell'80-90%, rispetto a solo il 14% nella fase avanzata con metastasi a distanza. La colonscopia è il metodo gold standard per la diagnosi del CRC. Oltre alla sua grande accuratezza, è una tecnica invasiva con notevoli rischi di mortalità, come perforazione intestinale e sanguinamento, che ne limitano l'utilizzo per lo screening. Il test del sangue occulto nelle feci, l'antigene dei carboidrati 19-9 (CA19-9) e l'antigene carcinoembrionario (CEA) sono i test di screening/marker tumorali (TM) per la diagnosi precoce del CRC attualmente disponibili. Sebbene i test CEA e CA19-9 siano semplici, non invasivi, convenienti e sicuri, la loro accuratezza diagnostica è limitata. Lo screening e la diagnosi precoce del CRC sono stati identificati come il fattore più significativo per ridurre la mortalità. I lunghi RNA non codificanti (lncRNA), costituiti da più di 200 nucleotidi, RNA non codificanti (ncRNA), sono sovraespressi o sottoregolati in numerose neoplasie e agiscono come potenziali mediatori molecolari per la progressione di vari tumori. Gli lncRNA sovraespressi agiscono come oncogeni migliorando la proliferazione delle cellule tumorali, l'apoptosi, l'invasione, la metastasi e l'autofagia. Diversi lncRNA sono stati collegati all'incidenza, alle metastasi e alla resistenza terapeutica del CRC. Ricerche recenti hanno suggerito che l'lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transidrogenasi-antisenso RNA1 (NNT-AS1), localizzato nel cromosoma umano 5p12, è coinvolto nella regolazione dell'espressione genica e svolge un ruolo importante in una varietà di tumori, come il cancro al seno, il cancro cervicale , carcinoma epatocellulare e osteosarcoma, tuttavia, è stata condotta una ricerca insufficiente sul ruolo dell'lncRNA NNT-AS1 nel CRC. I microRNA (miRNA) sono piccoli ncRNA con una lunghezza di circa 22 nucleotidi, che svolgono una varietà di funzioni biologiche come la proliferazione cellulare, l'apoptosi e l'angiogenesi. Le specie di miRNA mature, note anche come specie miRNA-5p (filamento guida) e specie -3p (miRNA passeggero), possono provenire da entrambi i bracci 5' e 3' del duplex precursore. Il braccio destinato ad essere caricato nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA è il filamento guida. Si presumeva che i miRNA passeggeri fossero stati completamente distrutti, tuttavia, indagini approfondite di sequenziamento hanno rivelato che alcuni miRNA minori mantengono e, di fatto, svolgono un ruolo significativo nella regolazione genetica. Numerosi studi hanno trovato una sostanziale associazione tra la disregolazione dei miR e le metastasi tumorali. L'Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p si trova sul cromosoma umano 14q32 ed è stato identificato come un gene antitumorale/soppressore del tumore in diverse neoplasie umane, attraverso il targeting e la regolazione dell'espressione dei geni di proliferazione e invasione cellulare a valle. La funzione regolatoria di hsa-miR-485-5p nel CRC è ancora indeterminata. L'interazione LncRNA-miR controllerebbe l'incidenza e/o la progressione di vari tipi di cancro, oltre ad essere considerata un potenziale bersaglio per future invenzioni terapeutiche. È stato scoperto che LncRNA NNT-AS1 promuove la proliferazione, la migrazione e l'invasione del colangiocarcinoma tramite spugnatura hsa-miR-485. Questo processo di spugnatura ha aumentato la β-catenina e la leucemia linfocitica cronica (LLC)/linfoma 9 (BCL9) a cellule B in risposta. La relazione tra LncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485-5p nel CRC resta da determinare clinicamente. Nella maggior parte delle cellule, in condizioni di non stress, la proteina da shock termico 90 (HSP90) è una chaperone molecolare altamente conservata che costituisce l'1-2% di tutte le proteine ​​cellulari. Funzioni importanti delle proteine ​​HSP90 includono il ripiegamento e la degradazione delle proteine. Fisiologicamente, le interazioni dello chaperone molecolare HSP90AB1 con altri co-chaperoni svolgono un ruolo cruciale nel ripiegamento delle proteine ​​appena generate o nella stabilizzazione e nel ripiegamento delle proteine ​​denaturate in seguito allo stress, ma, patologicamente, è coinvolto nella tumorigenesi. Ad esempio, nell'osteosarcoma, hsa-miR-485-5p si lega al 3'

-regione non tradotta (UTR) dell'RNA messaggero (mRNA) di HSP90 per ridurre la produzione della proteina HSP90, esercitando quindi un effetto soppressore del tumore. Pertanto, è giustificata la ricerca per determinare il significato clinico dell'asse lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 nei pazienti con CRC.

Il presente studio confronterà il livello di espressione nel sangue di lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485-5p, nonché i livelli sierici di HSP90 nei campioni di sangue periferico di coorte di pazienti egiziani sani e CRC. In secondo luogo, esaminare se l'asse lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90, o indagato individualmente, potrebbe essere utilizzato come biomarcatore di precisione molecolare non invasivo nella biopsia liquida per una migliore utilità diagnostica per i pazienti con CRC. Inoltre, in base alla stratificazione del gruppo di pazienti con CRC in base ai gradi istologici 1-3. Infine, indagare il probabile collegamento/correlazione tra lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 come asse o individualmente nella coorte di pazienti egiziani del CRC in relazione ai dati demografici o alle caratteristiche clinicopatologiche. Tutti i risultati saranno confermati o esclusi anche mediante metodi in silico.

3.1. Gruppo di pazienti Nello studio sono stati arruolati in totale 60 pazienti con CRC. I pazienti con CRC erano una coorte di pazienti egiziani naïve al trattamento ricoverati presso la Clinica di Oncologia Clinica, National Cancer Institute (NCI), Università del Cairo, Cairo, Egitto. Maschio-femmina 1:1 (30/30) e fascia di età 24-76 anni.

3.2. Gruppo di controllo composto da 28 volontari apparentemente sani, di pari età e sesso, selezionati casualmente tra i soggetti arruolati durante il normale esame di controllo o durante la donazione di sangue. I partecipanti al gruppo di controllo non assumevano alcun farmaco né soffrivano di alcuna malattia. La fascia di età dei controlli è 40-60 anni e 13:15 da maschio a femmina. Per il gruppo di pazienti (n = 60) è stata registrata un'anamnesi completa. Se un paziente soddisfaceva i criteri di inclusione e, dopo aver dato l'approvazione alla partecipazione allo studio e aver firmato il consenso informato, al momento della diagnosi venivano prelevati campioni di sangue periferico. Se un paziente soddisfaceva i criteri di esclusione, non venivano prelevati campioni di sangue. I criteri di inclusione dei pazienti erano quelli che si erano recati presso l'Unità di Colonscopia per un esame del colon-retto e presentavano una varietà di sintomi del colon, inclusi sintomi evidenti di CRC, stitichezza, dolore addominale, sanguinamento rettale e perdita di peso improvvisa. La diagnosi di CRC è stata confermata clinicamente dalla colonscopia, dalle radiografie addominali e dall'esame istopatologico. I criteri di esclusione dei pazienti includevano individui sottoposti a chemioterapia, radioterapia o sottoposti a intervento chirurgico, pazienti con malattie del sangue o qualsiasi cancro diverso dal CRC. Sono stati esclusi dallo studio gli individui con dati inadeguati o diagnosi istopatologiche mancanti, nonché quelli con metastasi a distanza.

3.2.1. Dati patologici e clinici dei pazienti La valutazione clinica dei pazienti con tumore CRC è stata effettuata presso l'Unità di Patologia, NCI, Cairo, Università del Cairo. Oltre alla storia della chirurgia colorettale del paziente, è stata registrata la storia familiare completa della malattia tumorale per tutti i partecipanti al CRC. Presso l'NCI, la stadiazione del CRC è stata determinata dai risultati della colonscopia, dalla radiografia addominale, dalle analisi patologiche e dalle decisioni cliniche, basandosi su questi risultati e sui criteri dell'American Joint Committee on Cancer (AJCC) del 2010. I pazienti sono classificati in tre fasi; stadio I/II: cancro locale, stadio III: coinvolgimento localizzato dei linfonodi (LN) (N1-x) e stadio IV: metastasi a distanza (M1). Il coinvolgimento dei linfonodi con incidenza dell'allargamento assente (N0) o presente (N1) è stato notato dalle cartelle cliniche dei pazienti. Sono stati registrati l'anamnesi familiare dei pazienti con CRC, lo stato di fumatore, lo stato di malattie non trasmissibili come diabete mellito (DM) e ipertensione (HTN). Sito del tumore, dimensione del tumore, mucinoso o meno, metastasi linfonodali (LNM), invasione tumorale o invasione vascolare, differenziazione del tumore, grado del tumore, stadiazione delle metastasi linfonodali (TNM), stato dell'infiammazione come malattia infiammatoria intestinale (IBD), CRC la posizione se del colon o del retto, così come se i sintomi clinici del CRC trasverso, sigmoideo, rettosigmoideo e rettale, sono stati valutati dall'Unità di analisi biochimica dell'NCI o dall'Unità di statistica, raccolti dai file dei pazienti. Emoglobina (Hgb), tempo di protrombina (PT), velocità di eritrosedimentazione (VES), conta piastrinica, conta linfocitaria, lattato deidrogenasi (LDH), proteina C-reattiva (CRP), sono stati tutti registrati dalle cartelle cliniche dei pazienti effettuate presso l'NCI, al Cairo. Egitto, Laboratorio Centrale di Biochimica Clinica. 4.2. Campioni di sangue Cinque millilitri di biopsia liquida di sangue venoso periferico sono stati raccolti dalla vena antecubitale dei controlli e dei pazienti con CRC in contenitori vacutainer con gel polimerico attivatore della coagulazione. I vacutainer dei campioni completamente coagulati sono stati centrifugati a 4000 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente (25 ◦C). Il siero raccolto è stato suddiviso in aliquote e conservato a -80 ◦C in tre provette Eppendorf prive di DNasi/RNasi fino all'analisi.

4.3. Estrazione dell'RNA totale L'RNA totale è stato estratto dai campioni di siero secondo le linee guida della procedura. L'RNA estratto è stato sciolto in 40 µL di acqua priva di RNasi e conservato in aliquote a -80 ◦C.

4.4. Quantificazione dell'RNA purificato compresi i miRNA La purezza e la concentrazione dell'RNA estratto vengono valutate utilizzando uno spettrofotometro. La quantità di RNA nel campione è stata valutata utilizzando l'assorbanza a 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/μL) e la purezza dell'RNA è stata valutata utilizzando l'assorbanza a rapporti di 260/280 nm.

4.5. Misurazione della trascrizione inversa e dell'espressione degli ncRNA mediante reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Il kit del primo filamento in tempo reale (RT2) è stato utilizzato per la sintesi del DNA complementare (cDNA) come indicato nelle istruzioni del produttore. Il cDNA ottenuto è stato conservato a -20 ◦C. Dopo la trascrizione inversa, qRT-PCR è stata utilizzata per misurare l'espressione dell'lncRNA NNT-AS1 per valutare il livello di espressione dell'lncRNA NNT-AS1, il primer RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. n. 330701) e i dati sono stati normalizzati utilizzando il test RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, cat. No. 330701) come controllo endogeno. 4.5.2. La sintesi del cDNA hsa-miR-485-5p è stata eseguita come indicato dalle linee guida della procedura. Il cDNA ottenuto è stato conservato a -20 ◦C. Dopo la trascrizione inversa, qRT-PCR è stata utilizzata per misurare l'espressione di hsa-miR-485-5p. Per rilevare il livello di espressione di hsa-miR-485-5p, è stato utilizzato il primer hsa-hsa-miR-485-5p e i dati sono stati normalizzati tramite miRNA PCR Assay (YP00203901, Cat. No. 339306) come controllo endogeno. Il livello di espressione dell'ncRNA come cambiamento di piega è stato calcolato e normalizzato utilizzando l'approccio della soglia del ciclo (Ct) come cambiamento di piega (2- ΔΔCt) con GAPDH o SNORD38B (hsa) come geni housekeeping per lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485 -5p, rispettivamente. ΔCt è stato calcolato deducendo i valori Ct di GAPDH e SNORD38B (hsa) da quelli di lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485-5p in studio, rispettivamente.

ΔΔCt = campioni tumorali ΔCt - campioni di controllo ΔCt dove (ΔCt=bersaglio Ct - riferimento Ct) 4.5.3. Quantificazione della proteina HSP90 mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) L'HSP90 è stato quantificato mediante ELISA utilizzando il kit disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore. L'ELISA sandwich in fase solida Human HSP90 alfa misura la quantità di bersaglio legato tra una coppia di anticorpi corrispondenti. Nei pozzetti della micropiastra fornita è stato pre-rivestito un anticorpo specifico per il bersaglio. In questi pozzetti, i campioni, gli standard o i controlli si legano all'anticorpo immobilizzato (catturato). Il sandwich viene costruito aggiungendo il secondo anticorpo (rivelatore), seguito dall'aggiunta di una soluzione substrato che interagisce con la combinazione enzima-anticorpo-bersaglio per fornire un segnale quantificabile. La forza di questo segnale è proporzionale alla concentrazione del target nel materiale originale.

4.5.4. Misurazione di CEA e CA19-9 mediante dosaggio immunologico con elettrochemiluminescenza Le concentrazioni sieriche di CA19-9 e CEA sono state misurate utilizzando un dosaggio immunologico con elettrochemiluminescenza utilizzando Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Nord America.

4.5.4.1. Test biochimici di routine. Test di funzionalità epatica: alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST) e albumina sierica. Per tutti i partecipanti sono stati determinati gli indicatori della funzionalità renale, la creatinina sierica e l'urea.

4.5.5. Rapporti e indici Il calcolo dell'indice di massa corporea (BMI) in kg/m2 è stato effettuato per tutti i partecipanti, dove peso normale = 18,5-24,9 kg/m2, sovrappeso = 25-29,9 kg/m2 e obesità = BMI pari o superiore a 30 kg/m2. Il rapporto piastrine/linfociti (PLR) è un indicatore correlato alla risposta immunitaria e un biomarcatore sistematico dell’infiammazione, che è superiore al rapporto neutrofili/linfociti per la correlazione con la gravità della malattia infiammatoria.