LncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-Antisense RNA1 NNT-AS1 in CRC

Colorectale kanker (CRC) is een heterogene maligniteit die de dikke darm en het rectum aantast. Het is de derde meest voorkomende en dodelijke maligniteit, met ongeveer 1,9 miljoen nieuwe gevallen en bijna 9,4% van de kankergerelateerde sterfgevallen in 2020 wereldwijd. Het overlevingspercentage van CRC is grotendeels afhankelijk van het stadium van de ziekte op het moment van diagnose. Vroege detectie van CRC biedt dus een hogere vijfjaarsoverlevingskans van 80-90%, vergeleken met slechts 14% in het late stadium met metastasen op afstand. Colonoscopie is de gouden standaardmethode voor de diagnose van colorectale (darm)kanker. Naast de grote nauwkeurigheid is het een invasieve techniek met aanzienlijke sterfterisico's, zoals darmperforatie en bloeding, waardoor het gebruik ervan voor screening beperkt is. Fecaal occult bloedonderzoek, koolhydraatantigeen 19-9 (CA19-9) en carcino-embryonaal antigeen (CEA) zijn de momenteel beschikbare CRC-tests voor vroege diagnose screening/tumormarkers (TM's). Hoewel CEA- en CA19-9-tests eenvoudig, niet-invasief, betaalbaar en veilig zijn, is hun diagnostische nauwkeurigheid beperkt. Screening en vroege diagnose van CRC zijn geïdentificeerd als de belangrijkste factor voor het verlagen van de mortaliteit. Lang niet-coderend RNA (lncRNA), dat bestaat uit meer dan 200 nucleotiden, niet-coderende RNA's (ncRNA's), worden bij talrijke maligniteiten tot overexpressie gebracht of naar beneden gereguleerd, en fungeren als potentiële moleculaire bemiddelaars voor de progressie van verschillende tumoren. Tot overexpressie gebrachte lncRNA's werken als oncogenen die de proliferatie, apoptose, invasie, metastase en autofagie van tumorcellen versterken. Verschillende lncRNA's zijn in verband gebracht met de incidentie, metastase en therapeutische resistentie van CRC. Recent onderzoek suggereerde dat het lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1 (NNT-AS1), dat gelokaliseerd is in het menselijke 5p12-chromosoom, betrokken is bij de regulatie van genexpressie en een belangrijke rol speelt bij een verscheidenheid aan kankers, zoals borstkanker en baarmoederhalskanker. , hepatocellulair carcinoom en osteosarcoom, er is echter onvoldoende onderzoek gedaan naar de rol van lncRNA NNT-AS1 in CRC. MicroRNA's (miRNA's) zijn kleine ncRNA's met een lengte van ongeveer 22 nucleotiden, die een verscheidenheid aan biologische functies vervullen, zoals celproliferatie, apoptose en angiogenese. De volwassen miRNA-soorten, ook bekend als de miRNA-5p- (gids'-streng) en -3p-soort (passagiers-miRNA), kunnen afkomstig zijn van zowel de 5'- als de 3'-arm van de precursorduplex. De arm die bestemd is om in het RNA-geïnduceerde silencing-complex te worden geladen, is de gidsstreng. Er werd aangenomen dat miRNA's van passagiers volledig vernietigd waren, maar diepgaand onderzoek naar de sequentie heeft aangetoond dat bepaalde kleine miRNA's een betekenisvolle rol behouden en in feite een betekenisvolle rol spelen in de genregulatie. Talrijke onderzoeken hebben een substantieel verband gevonden tussen ontregeling van miRs en tumormetastase. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p bevindt zich op het menselijke chromosoom 14q32 en is geïdentificeerd als een antikanker-/tumor-suppressorgen bij verschillende menselijke maligniteiten, door zich te richten op en de expressie van stroomafwaartse celproliferatie- en invasiegenen te reguleren. De regulerende functie van hsa-miR-485-5p in CRC is nog steeds onbepaald. De interactie tussen LncRNAs en miRs zou de incidentie en/of progressie van verschillende soorten kanker controleren, en zou ook worden beschouwd als een potentieel doelwit voor toekomstige behandelingsuitvindingen. LncRNA NNT-AS1 bleek de proliferatie, migratie en invasie van cholangiocarcinoom te bevorderen via het sponsen van hsa-miR-485. Dit sponsproces verhoogde als reactie hierop β-catenine en B-cel chronische lymfatische leukemie (CLL) / lymfoom 9 (BCL9). De relatie van LncRNA NNT-AS1 tot hsa-miR-485-5p in CRC moet nog klinisch worden bepaald. In de meeste cellen zijn hitteschokproteïne 90 (HSP90) onder niet-stressomstandigheden sterk geconserveerde moleculaire chaperonnes die 1-2% van alle cellulaire eiwitten uitmaken. Belangrijke functies van HSP90-eiwitten zijn onder meer het vouwen en afbreken van eiwitten. Fysiologisch spelen de moleculaire chaperonne-HSP90AB1-interacties met andere co-chaperonnes een cruciale rol bij het vouwen van de nieuw gegenereerde eiwitten of bij het stabiliseren en hervouwen van gedenatureerde eiwitten na stress, maar zijn pathologisch gezien betrokken bij tumorigenese. Bij osteosarcoom bindt hsa-miR-485-5p bijvoorbeeld aan de 3'

-niet-getranslateerd gebied (UTR) van HSP90-messenger-RNA (mRNA) om de productie van HSP90-eiwit te verminderen, waardoor een tumoronderdrukkend effect wordt uitgeoefend. Daarom is onderzoek gerechtvaardigd om de klinische betekenis van de lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-as bij CRC-patiënten te bepalen.

De huidige studie zal het bloedexpressieniveau van lncRNA NNT-AS1 en hsa-miR-485-5p vergelijken, evenals de HSP90-serumniveaus in perifere bloedmonsters van zowel gezonde als CRC Egyptische patiënten. Ten tweede, onderzoeken of de lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-as, of individueel onderzocht, zou worden gebruikt als niet-invasieve moleculaire precisie-biomarker in vloeibare biopsie voor een beter diagnostisch nut voor CRC-patiënten. Ook gebaseerd op de groepsstratificatie van CRC-patiënten volgens histologische graad 1-3. Onderzoek ten slotte de waarschijnlijke link/correlatie tussen lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 als een as of individueel in het cohort van Egyptische CRC-patiënten in relatie tot demografische gegevens of klinisch-pathologische kenmerken. Alle bevindingen zullen ook in silico-middelen worden bevestigd of uitgesloten.

3.1. Patiëntengroep In totaal namen 60 CRC-patiënten deel aan het onderzoek. CRC-patiënten waren behandelingsnaïeve Egyptische patiëntencohorten die waren opgenomen in de Clinical Oncology Clinic, National Cancer Institute (NCI), Cairo University, Cairo, Egypte. Man-naar-vrouw 1:1 (30/30) en hun leeftijdscategorie 24-76 jaar.

3.2. Controlegroep 28 ogenschijnlijk gezonde vrijwilligers van dezelfde leeftijd en geslacht, willekeurig geselecteerd uit proefpersonen die werden opgenomen tijdens een normaal controleonderzoek of tijdens bloeddonatie. De deelnemers uit de controlegroep gebruikten geen medicijnen en leden niet aan een ziekte. De leeftijdscategorie van de controles is 40-60 jaar en 13:15 man-vrouw. Voor de patiëntengroep (n = 60) werd een volledige geschiedenis geregistreerd. Als een patiënt voldeed aan de inclusiecriteria en na goedkeuring voor deelname aan het onderzoek en ondertekening van de geïnformeerde toestemming, werden op het moment van de diagnose perifere bloedmonsters genomen. Als een patiënt aan de uitsluitingscriteria voldeed, werd er geen bloed afgenomen. Criteria voor de inclusie van patiënten waren degenen die de colonoscopie-eenheid bezochten voor colorectaal onderzoek en een verscheidenheid aan colonsymptomen hadden, waaronder opvallende CRC-symptomen, constipatie, buikpijn, rectale bloeding en plotseling gewichtsverlies. De diagnose CRC werd klinisch bevestigd door colonoscopie, radiografische beeldvorming van de buik en histopathologisch onderzoek. Uitsluitingscriteria voor patiënten waren onder meer personen die chemotherapie kregen, bestraling kregen of een operatie ondergingen, patiënten met bloedaandoeningen of andere vormen van kanker dan CRC. Personen met ontoereikende gegevens of ontbrekende histopathologische diagnoses, evenals personen met metastasen op afstand, werden uitgesloten van het onderzoek.

3.2.1. Pathologische en klinische gegevens van patiënten De klinische beoordeling van de tumor van CRC-patiënten werd uitgevoerd bij de Pathologie-eenheid, NCI, Caïro, Universiteit van Caïro. Naast de geschiedenis van colorectale chirurgie van de patiënt, werd de volledige familiegeschiedenis van kankerziekte geregistreerd voor alle CRC-deelnemers. Bij het NCI werd de stadiëring van CRC bepaald aan de hand van de colonoscopische resultaten, abdominale radiografie, pathologische analyses en klinische beslissingen, op basis van deze resultaten en de criteria van de American Joint Committee on Cancer (AJCC) uit 2010. Patiënten worden onderverdeeld in drie fasen; stadium I/II: lokale kanker, stadium III: gelokaliseerde betrokkenheid van de lymfeklieren (LN) (N1-x), en stadium IV: metastase op afstand (M1). De betrokkenheid van LN bij de incidentie van vergroting als geen (N0) of aanwezig (N1) werd opgemerkt uit patiëntendossiers. De familiegeschiedenis van de CRC-patiënten, de rookstatus en de status van niet-overdraagbare ziekten zoals diabetes mellitus (DM) en hypertensie (HTN) werden geregistreerd. Tumorplaats, tumorgrootte, al dan niet slijmerig, lymfekliermetastase (LNM), tumorinvasie of vasculaire invasie, tumordifferentiatie, tumorgraad, stadiëring van tumorknoopmetastase (TNM), ontstekingsstatus als inflammatoire darmziekte (IBD), CRC locatie indien colon- of rectaal, evenals indien transversaal, sigmoïd, rectosigmoïd en rectaal, CRC klinische symptomen werden beoordeeld door de NCI Biochemical Analysis Unit of de Statistics Unit, verzameld uit patiëntendossiers. Hemoglobine (Hgb), protrombinetijd (PT), erytrocytsedimentatiesnelheid (ESR), aantal bloedplaatjes, aantal lymfocyten, lactaatdehydrogenase (LDH), C-reactief proteïne (CRP) werden allemaal geregistreerd uit patiëntendossiers die werden opgesteld bij het NCI, Caïro. Egypte, Centraal Klinisch Biochemielaboratorium. 4.2. Bloedmonsters Vijf milliliter vloeistofbiopsie van perifeer veneus bloed werd verzameld uit de antecubitale ader van controlepatiënten en CRC-patiënten in vacutainers van polymeergel met stolselactivator. Vacutainers van volledig gecoaguleerde monsters werden gedurende 10 minuten bij 4000 rpm bij kamertemperatuur (25 ◦C) gecentrifugeerd. Het verzamelde serum werd in porties verdeeld en tot analyse in drie DNase/RNase-vrije Eppendorf-buisjes bij -80 °C gehouden.

4.3. Totaal RNA-extractie Totaal RNA werd uit serummonsters geëxtraheerd volgens de procedurerichtlijnen. Het geëxtraheerde RNA werd opgelost in 40 µl RNase-vrij water en in porties bewaard bij -80 °C.

4.4. Kwantificering van gezuiverd RNA inclusief miRNA's. De zuiverheid en concentratie van het geëxtraheerde RNA worden beoordeeld met behulp van een spectrofotometer. De hoeveelheid RNA in het monster werd beoordeeld met behulp van absorptie bij 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/μL), en de RNA-zuiverheid werd beoordeeld met behulp van absorptie bij verhoudingen van 260/280 nm.

4.5. Omgekeerde transcriptie en expressiemeting van ncRNA's met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 De real-time (RT2) First Strand Kit werd gebruikt voor complementaire DNA (cDNA)-synthese zoals voorgeschreven door de instructies van de fabrikant. Het verkregen cDNA werd bewaard bij -20 ◦C. Na omgekeerde transcriptie werd qRT-PCR gebruikt om de expressie van het lncRNA NNT-AS1 te meten om het expressieniveau van het lncRNA NNT-AS1 te evalueren, de primer RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. nr. 330701) werd gebruikt en de gegevens werden genormaliseerd met behulp van RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. nr. 330701) als endogene controle. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA-synthese werd uitgevoerd zoals voorgeschreven door de procedurerichtlijnen. Het verkregen cDNA werd bewaard bij -20 ◦C. Na omgekeerde transcriptie werd qRT-PCR gebruikt om de expressie van de hsa-miR-485-5p te meten. Om het expressieniveau van de hsa-miR-485-5p te detecteren, werd de primer hsa-hsa-miR-485-5p gebruikt en werden de gegevens genormaliseerde miRNA PCR-assay (YP00203901, Cat. nr. 339306) als endogene controle. Het ncRNA-expressieniveau als vouwverandering werd berekend en genormaliseerd door gebruik te maken van de cyclusdrempelbenadering (Ct) als vouwverandering (2-ΔΔCt) met GAPDH of SNORD38B (hsa) als de huishoudgenen voor lncRNA NNT-AS1 en hsa-miR-485 -5 cent, respectievelijk. ΔCt werd berekend door de Ct-waarden van GAPDH en SNORD38B (hsa) af te trekken van die van respectievelijk het onderzochte lncRNA NNT-AS1 en hsa-miR-485-5p.

ΔΔCt = ΔCt-kankermonsters - ΔCt-controlemonsters waarbij (ΔCt=Ct-doelwit - Ct-referentie) 4.5.3. Kwantificering van HSP90-eiwit door middel van Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) De HSP90 werd gekwantificeerd door middel van ELISA met behulp van de in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant. De menselijke HSP90 alfa vaste-fase sandwich-ELISA meet de hoeveelheid doelwit gebonden tussen een passend antilichaampaar. In de putjes van de meegeleverde microtiterplaat is een doelspecifiek antilichaam vooraf gecoat. In deze putjes binden monsters, standaarden of controles aan het geïmmobiliseerde (vang)antilichaam. De sandwich wordt geconstrueerd door het tweede (detector)antilichaam toe te voegen, gevolgd door de toevoeging van een substraatoplossing die interageert met de enzym-antilichaam-doelwitcombinatie om een ​​kwantificeerbaar signaal te geven. De sterkte van dit signaal is evenredig met de concentratie van het doel in het oorspronkelijke materiaal.

4.5.4. CEA- en CA19-9-meting door middel van elektrochemiluminescentie-immunoassay CA19-9- en CEA-serumconcentraties werden gemeten met behulp van een elektrochemiluminescentie-immunoassay met behulp van Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Noord-Amerika.

4.5.4.1. Routinematig biochemisch testen. Leverfunctietesten: alanineaminotransferase (ALT), aspartaataminotransferase (AST) en serumalbumine. Nierfunctie-indicatoren serumcreatinine en ureum werden voor alle deelnemers bepaald.

4.5.5. Verhoudingen en indexen De berekening van de Body Mass Index (BMI) in kg/m2 werd voor alle deelnemers uitgevoerd, waarbij het normale gewicht = 18,5-24,9 kg/m2, overgewicht = 25-29,9 kg/m2, en obesitas = BMI van 30 kg/m2 of meer morbide obesitas. De bloedplaatjes-tot-lymfocytenratio (PLR) is een immuunresponsgerelateerde indicator en systematische ontstekingsbiomarker, die superieur is aan de neutrofielen-lymfocytenratio voor correlatie met de ernst van ontstekingsziekten.