LncRNA Nikotinamid nukleotid transhydrogenáza-antisense RNA1 NNT-AS1 v CRC

Kolorektální karcinom (CRC) je heterogenní malignita, která postihuje tlusté střevo a konečník. Je to třetí nejrozšířenější a smrtelná malignita s přibližně 1,9 milionu nových případů a téměř 9,4 % úmrtí souvisejících s rakovinou v roce 2020 na celém světě. Míra přežití CRC většinou závisí na stadiu onemocnění v době diagnózy. Včasná detekce CRC tedy poskytuje vyšší pravděpodobnost 5letého přežití 80–90 % ve srovnání s pouhými 14 % v pozdním stadiu se vzdálenými metastázami. Kolonoskopie je zlatým standardem pro diagnostiku CRC. Kromě vysoké přesnosti jde o invazivní techniku ​​se značnými úmrtními riziky, jako je perforace střeva a krvácení, což omezuje její použití pro screening. Test na okultní krvácení ve stolici, sacharidový antigen 19-9 (CA19-9) a karcinoembryonální antigen (CEA) jsou v současnosti dostupné screeningové testy CRC časné diagnózy/testy nádorových markerů (TMs). Ačkoli jsou testy CEA a CA19-9 jednoduché, neinvazivní, cenově dostupné a bezpečné, jejich diagnostická přesnost je omezená. Screening a včasná diagnostika CRC byly identifikovány jako nejvýznamnější faktor pro snížení mortality. Dlouhá nekódující RNA (lncRNA), což jsou více než 200 nukleotidové nekódující RNA (ncRNA), jsou buď nadměrně exprimovány, nebo down-regulovány u řady malignit a působí jako potenciální molekulární mediátory pro progresi různých nádorů. Nadměrně exprimované lncRNA působí jako onkogeny zvyšující proliferaci nádorových buněk, apoptózu, invazi, metastázy a autofagii. Několik lncRNA bylo spojeno s výskytem, ​​metastázami a terapeutickou rezistencí CRC. Nedávný výzkum naznačil, že lncRNA nikotinamidová nukleotidová transhydrogenáza-antisense RNA1 (NNT-AS1), která je lokalizována v lidském chromozomu 5p12, se podílí na regulaci genové exprese a hraje důležitou roli u různých druhů rakoviny, jako je rakovina prsu, rakovina děložního čípku. , hepatocelulární karcinom a osteosarkom, nicméně nebyl proveden dostatečný výzkum o roli lncRNA NNT-AS1 v CRC. MikroRNA (miRNA) jsou malé ncRNA s délkou ~ 22 nukleotidů, které provádějí různé biologické funkce, jako je buněčná proliferace, apoptóza a angiogeneze. Zralé druhy miRNA, také známé jako miRNA-5p (vodící řetězec) a -3p druhy (miRNA cestujících), mohou pocházet z 5' i 3' ramen prekurzorového duplexu. Rameno, které má být naloženo do RNA-indukovaného umlčovacího komplexu, je vodicí vlákno. Předpokládalo se, že miRNA cestujících jsou zcela zničeny, nicméně hloubkové sekvenování odhalilo, že určité minoritní miRNA si zachovávají a ve skutečnosti hrají významnou roli v genové regulaci. Četné studie nalezly podstatnou souvislost mezi dysregulací miRs a metastázami nádoru. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p se nachází na lidském chromozomu 14q32 a byl identifikován jako protirakovinný/tumor supresorový gen u několika lidských malignit prostřednictvím cílení a regulace exprese následných buněčných proliferačních a invazních genů. Regulační funkce hsa-miR-485-5p v CRC je stále neznámá. Interakce LncRNAs-miRs by řídila incidenci a/nebo progresi různých typů rakoviny a byla by také považována za potenciální cíl pro budoucí vynález léčby. Bylo zjištěno, že LncRNA NNT-AS1 podporuje proliferaci, migraci a invazi cholangiokarcinomu prostřednictvím houbovitého hsa-miR-485. Tento houbovitý proces v reakci zvýšil β-katenin a B-buněčnou chronickou lymfocytární leukémii (CLL)/lymfom 9 (BCL9). Vztah LncRNA NNT-AS1 k hsa-miR-485-5p u CRC zbývá klinicky určit. Ve většině buněk, v prostředí bez stresu, jsou protein tepelného šoku 90 (HSP90) vysoce konzervované molekulární chaperony, které tvoří 1–2 % všech buněčných proteinů. Mezi důležité funkce proteinů HSP90 patří skládání a degradace proteinů. Fyziologicky hrají interakce molekulárního chaperonu HSP90AB1 s jinými ko-chaperony klíčovou roli při skládání nově generovaných proteinů nebo při stabilizaci a opětovném skládání denaturovaných proteinů po stresu, ale patologicky se podílí na tumorigenezi. Například u osteosarkomu se hsa-miR-485-5p váže na 3'

-netranslatovaná oblast (UTR) HSP90 messenger RNA (mRNA), aby se snížila produkce proteinu HSP90, a tím se projevil tumor supresorový účinek. Proto je oprávněný výzkum ke stanovení klinického významu osy lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 u pacientů s CRC.

Současná studie bude porovnávat hladinu exprese lncRNA NNT-AS1 a hsa-miR-485-5p v krvi a také hladiny HSP90 v séru ve vzorcích periferní krve kohorty egyptských pacientů zdravých i CRC. Za druhé, prozkoumejte, zda by osa lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 nebo jednotlivě vyšetřená byla použita jako neinvazivní biomarker s molekulární přesností v tekuté biopsii pro lepší diagnostické využití u pacientů s CRC. Také na základě skupinové stratifikace pacientů s CRC podle histologických stupňů 1-3. Nakonec prozkoumejte pravděpodobnou souvislost/korelaci mezi lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 jako osou nebo individuálně v kohortě egyptských pacientů s CRC ve vztahu k demografickým datům nebo klinickopatologickým charakteristikám. Všechny nálezy budou potvrzeny nebo vyloučeny také prostředky in silico.

3.1. Skupina pacientů Do studie bylo zařazeno celkem 60 pacientů s CRC. Pacienti s CRC byli kohortou egyptských pacientů dosud neléčených, kteří byli přijati na kliniku klinické onkologie, National Cancer Institute (NCI), Cairo University, Cairo, Egypt. Muž k ženě 1:1 (30/30) a jejich věkové rozmezí 24–76 let.

3.2. Kontrolní skupina 28 zdánlivě zdravých dobrovolníků stejného věku a pohlaví, náhodně vybraných ze subjektů zařazených během normálního kontrolního vyšetření nebo během dárcovství krve. Účastníci kontrolní skupiny neužívali žádné léky ani netrpěli žádnou nemocí. Věkové rozmezí kontrol je 40-60 let a 13:15 muž-žena. U skupiny pacientů (n = 60) byla zaznamenána úplná anamnéza. Pokud pacient splnil kritéria pro zařazení a po udělení souhlasu s účastí ve studii a podepsání informovaného souhlasu, byly v době diagnózy odebrány vzorky periferní krve. Pokud pacient splnil kritéria vyloučení, vzorky krve nebyly odebrány. Kritériem pro zařazení pacientů byli ti, kteří navštívili kolonoskopickou jednotku pro kolorektální vyšetření a měli různé symptomy tlustého střeva, včetně znatelných symptomů CRC, zácpy, bolesti břicha, krvácení z konečníku a náhlého úbytku hmotnosti. Diagnóza CRC byla klinicky potvrzena kolonoskopií, abdominálním radiozobrazením a histopatologickým vyšetřením. Kritéria pro vyloučení pacientů zahrnovala jednotlivce, kteří podstoupili chemoterapii, ozařování nebo podstoupili chirurgický zákrok, pacienty s krevními poruchami nebo jakoukoli jinou rakovinou než CRC. Jedinci s neadekvátními údaji nebo chybějícími histopatologickými diagnózami, stejně jako ti se vzdálenými metastázami, byli ze studie vyloučeni.

3.2.1. Patologická a klinická data pacientů Klinické hodnocení nádoru pacientů s CRC bylo provedeno na Patologické jednotce, NCI, Cairo, Cairo University. Kromě anamnézy pacientů s kolorektálním chirurgickým zákrokem byla u všech účastníků CRC zaznamenána kompletní rodinná anamnéza nádorového onemocnění. Na NCI byl staging CRC stanoven na základě kolonoskopických výsledků, radiografie břicha, patologických analýz a klinických rozhodnutí, přičemž se spoléhalo na tyto výsledky a kritéria Amerického smíšeného výboru pro rakovinu (AJCC) z roku 2010. Pacienti jsou rozděleni do tří stupňů; stadium I/II: lokální karcinom, stadium III: lokalizované postižení lymfatických uzlin (LN) (N1-x) a stadium IV: vzdálené metastázy (M1). Postižení LN s výskytem zvětšení buď žádné (N0) nebo přítomné (N1), bylo zaznamenáno ze záznamů pacientů. Byla zaznamenávána rodinná anamnéza pacientů s CRC, kuřácký stav, stavy neinfekčních onemocnění jako diabetes mellitus (DM) a hypertenze (HTN). Místo nádoru, velikost nádoru, mucinózní nebo ne, metastázy do lymfatických uzlin (LNM), invaze nádoru nebo vaskulární invaze, diferenciace nádoru, stupeň nádoru, staging nádoru-uzliny-metastázy (TNM), stav zánětu jako zánětlivé onemocnění střev (IBD), CRC lokalizace, pokud kolon nebo rektální, stejně jako v případě příčných, sigmoidních, rektosigmoidních a rektálních klinických příznaků CRC, byly hodnoceny jednotkou biochemické analýzy NCI nebo jednotkou statistiky shromážděnými ze souborů pacientů. Hemoglobin (Hgb), protrombinový čas (PT), rychlost sedimentace erytrocytů (ESR), počet krevních destiček, počet lymfocytů, laktátdehydrogenáza (LDH), C-reaktivní protein (CRP), všechny byly zaznamenány ze spisů pacientů provedených v NCI v Káhiře Egypt, Centrální laboratoř klinické biochemie. 4.2. Vzorky krve Pět mililitrů tekuté biopsie periferní žilní krve bylo odebráno z antekubitální žíly od kontrol a pacientů s CRC do vakuových nádob s polymerním gelem aktivátoru sraženiny. Vacutainery kompletně koagulovaných vzorků byly centrifugovány při 4000 ot./min. po dobu 10 minut při teplotě místnosti (25 °C). Odebrané sérum bylo rozděleno na alikvoty a udržováno při -80 °C ve třech Eppendorfových zkumavkách bez DNázy/RNázy až do analýzy.

4.3. Extrakce celkové RNA Celková RNA byla extrahována ze vzorků séra podle pokynů postupu. Extrahovaná RNA byla rozpuštěna ve 40 ul vody bez RNázy a skladována v alikvotech při -80 °C.

4.4. Kvantifikace purifikované RNA včetně miRNA Čistota a koncentrace extrahované RNA se hodnotí pomocí spektrofotometru. Množství RNA ve vzorku bylo hodnoceno pomocí absorbance při 260 nm (A260 = 1 -> 44 ng/ul) a čistota RNA byla hodnocena pomocí absorbance při poměrech 260/280 nm.

4.5. Měření reverzní transkripce a exprese ncRNA pomocí kvantitativní reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Souprava prvního vlákna v reálném čase (RT2) byla použita pro syntézu komplementární DNA (cDNA) podle pokynů výrobce. Získaná cDNA byla skladována při -20 °C. Po reverzní transkripci byla qRT-PCR použita k měření exprese lncRNA NNT-AS1 k vyhodnocení úrovně exprese lncRNA NNT-AS1, primer RT2 lncRNA qPCR Assay pro lidský NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. č. 330701) a data byla normalizována pomocí RT2 lncRNA qPCR testu pro lidský GAPDH (LPH31725A-200, kat.č. č. 330701) jako endogenní kontrola. 4.5.2. Syntéza cDNA hsa-miR-485-5p byla provedena podle pokynů postupu. Získaná cDNA byla skladována při -20 °C. Po reverzní transkripci byla k měření exprese hsa-miR-485-5p použita qRT-PCR. K detekci hladiny exprese hsa-miR-485-5p byl použit primer hsa-hsa-miR-485-5p a data byla normalizována miRNA PCR Assay (YP00203901, Cat. č. 339306) jako endogenní kontrola. Úroveň exprese ncRNA jako násobná změna byla vypočtena a normalizována pomocí přístupu prahu cyklu (Ct) jako násobná změna (2- ΔACt) s GAPDH nebo SNORD38B (hsa) jako provozními geny pro lncRNA NNT-AS1 a hsa-miR-485 -5p, resp. ACT byl vypočten odečtením hodnot Ct GAPDH a SNORD38B (hsa) od hodnot studovaných lncRNA NNT-AS1 a hsa-miR-485-5p.

ΔΔCt = ΔCt vzorky rakoviny – ΔCt kontrolní vzorky kde (ΔCt=Ct cíl – Ct reference) 4.5.3. Kvantifikace proteinu HSP90 metodou ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) HSP90 byla kvantifikována metodou ELISA za použití komerčně dostupné soupravy podle pokynů výrobce. Sendvičová ELISA na pevné fázi lidského HSP90 alfa měří množství cíle vázaného mezi párem odpovídajících protilátek. V jamkách dodané mikrodestičky byla předem potažena cílově specifická protilátka. V těchto jamkách se vzorky, standardy nebo kontroly vážou na imobilizovanou (zachycovací) protilátku. Sendvič je zkonstruován přidáním druhé (detekční) protilátky, následovaným přidáním roztoku substrátu, který interaguje s kombinací enzym-protilátka-cíl, aby poskytl kvantifikovatelný signál. Síla tohoto signálu je úměrná koncentraci cíle v původním materiálu.

4.5.4. Měření CEA a CA19-9 pomocí elektrochemiluminiscenčního imunotestu Koncentrace CA19-9 a CEA v séru byly měřeny pomocí elektrochemiluminiscenčního imunotestu s použitím Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Severní Amerika.

4.5.4.1. Rutinní biochemické testování. Jaterní funkční testy: alaninaminotransferáza (ALT), aspartátaminotransferáza (AST) a sérový albumin. U všech účastníků byly stanoveny indikátory funkce ledvin sérový kreatinin a urea.

4.5.5. Poměry a indexy Výpočet indexu tělesné hmotnosti (BMI) v kg/m2 byl proveden pro všechny účastníky, kde normální hmotnost = 18,5-24,9 kg/m2, nadváha = 25-29,9 kg/m2 a obezita = BMI 30 kg/m2 nebo vyšší morbidní obezita. Poměr krevních destiček k lymfocytům (PLR) je indikátor související s imunitní odpovědí a biomarker systematického zánětu, který je lepší než poměr neutrofilů a lymfocytů pro korelaci se závažností zánětlivého onemocnění.