LncRNA Nicotinamid Nucleotid Transhydrogenase-Antisense RNA1 NNT-AS1 i CRC

Kolorektal cancer (CRC) er en heterogen malignitet, der påvirker tyktarmen og endetarmen. Det er den tredje mest udbredte og dødelige malignitet med omkring 1,9 millioner nye tilfælde og næsten 9,4 % af kræftrelaterede dødsfald i 2020 på verdensplan. CRC-overlevelsesraten afhænger for det meste af sygdommens stadium på diagnosetidspunktet. Således giver tidlig påvisning af CRC en højere 5-års overlevelsessandsynlighed på 80-90% sammenlignet med kun 14% i det sene stadie med fjernmetastaser. Koloskopi er guldstandardmetoden til CRC-diagnose. Ud over dens store nøjagtighed er det en invasiv teknik med betydelige dødelighedsrisici, såsom tarmperforering og blødning, hvilket begrænser dens anvendelse til screening. Fækal okkult blodprøve, kulhydratantigen 19-9 (CA19-9) og carcinoembryonalt antigen (CEA) er de i øjeblikket tilgængelige CRC-test for tidlig diagnosescreening/tumormarkører (TM'er). Selvom CEA- og CA19-9-tests er enkle, ikke-invasive, overkommelige og sikre, er deres diagnostiske nøjagtighed begrænset. Screening og tidlig diagnose for CRC er blevet identificeret som den vigtigste faktor for at sænke dødeligheden. Langt ikke-kodende RNA (lncRNA), som er mere end 200 nukleotider ikke-kodende RNA'er (ncRNA'er), er enten overudtrykt eller nedreguleret i adskillige maligniteter og fungerer som potentielle molekylære mediatorer for forskellige tumorprogression. Overudtrykte lncRNA'er fungerer som onkogener, der øger tumorcelleproliferation, apoptose, invasion, metastase og autofagi. Adskillige lncRNA'er er blevet forbundet med forekomsten, metastasen og terapeutisk resistens af CRC. Nyere forskning antydede, at lncRNA Nicotinamid Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1 (NNT-AS1), som er lokaliseret i det 5p12 humane kromosom, er involveret i genekspressionsregulering og spiller vigtige roller i en række kræftformer, såsom brystkræft, livmoderhalskræft. , hepatocellulært karcinom og osteosarkom, blev der imidlertid ikke udført tilstrækkelig forskning om lncRNA NNT-AS1 rolle i CRC. MikroRNA'er (miRNA'er) er små ncRNA'er med ~22 nukleotiders længde, der udfører en række biologiske funktioner såsom celleproliferation, apoptose og angiogenese. De modne miRNA-arter, også kendt som miRNA-5p (guide'-streng) og -3p-arter (passager miRNA), kan stamme fra både 5'- og 3'-armene af precursor-duplexen. Armen, der er bestemt til at blive indlæst i det RNA-inducerede lyddæmpningskompleks, er guidestrengen. Passager miRNA'er blev antaget at være fuldstændig ødelagt, men dybe sekventeringsundersøgelser har afsløret, at visse mindre miRNA'er bevarer og faktisk spiller en meningsfuld rolle i genregulering. Talrige undersøgelser har fundet en væsentlig sammenhæng mellem miRs dysregulering og tumormetastaser. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p er placeret på det humane kromosom 14q32 og er blevet identificeret som et anticancer/tumor suppressorgen i adskillige humane maligniteter gennem målretning og regulering af ekspressionen af ​​nedstrøms celleproliferation og invasionsgener. Den regulatoriske funktion af hsa-miR-485-5p i CRC er stadig ubestemt. LncRNAs-miRs interaktion ville kontrollere forekomsten og/eller progressionen af ​​forskellige cancertyper, såvel som at blive betragtet som et potentielt mål for fremtidig behandlingsopfindelse. LncRNA NNT-AS1 viste sig at fremme spredning, migration og invasion af cholangiocarcinom via sponging hsa-miR-485. Denne svampeproces forhøjede β-catenin og B-celle kronisk lymfatisk leukæmi (CLL)/lymfom 9 (BCL9) som reaktion. LncRNA NNT-AS1's relation til hsa-miR-485-5p i CRC skal stadig bestemmes klinisk. I de fleste celler, under ikke-stress-indstillinger, er varmechokprotein 90 (HSP90) stærkt bevarede molekylære chaperoner, der udgør 1-2% af alle cellulære proteiner. Vigtige funktioner af HSP90-proteiner omfatter proteinfoldning og nedbrydning. Fysiologisk spiller den molekylære chaperon HSP90AB1-interaktioner med andre co-chaperoner en afgørende rolle for foldning af de nygenererede proteiner eller i stabilisering og genfoldning af denaturerede proteiner efter stress, men er patologisk involveret i tumorigenese. For eksempel, inden for osteosarkom binder hsa-miR-485-5p til 3'

-utranslateret region (UTR) af HSP90-messenger-RNA (mRNA) for at reducere HSP90-proteinproduktionen, og dermed udøve en tumorundertrykkende effekt. Derfor er forskning berettiget til at bestemme den kliniske betydning af lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-aksen hos CRC-patienter.

Den nuværende undersøgelse vil sammenligne blodekspressionsniveauet af lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485-5p, samt HSP90 serumniveauer i både raske og CRC egyptiske patienters kohorte perifere blodprøver. For det andet skal du undersøge, om lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-aksen, eller individuelt undersøgt, ville blive brugt som ikke-invasiv molekylær præcisionsbiomarkør i flydende biopsi for bedre diagnostisk anvendelighed for CRC-patienter. Også baseret på CRC-patienters gruppestratificering efter histologisk grad 1-3. Undersøg endelig den sandsynlige sammenhæng/korrelation mellem lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 som en akse eller individuelt i CRC egyptiske patienters kohorte i forhold til demografiske data eller klinikopatologiske karakteristika. Alle resultater vil også blive bekræftet eller udelukket af in silico-metoder.

3.1. Patientgruppe I alt 60 CRC-patienter blev inkluderet i undersøgelsen. CRC-patienter var behandlingsnaive egyptiske patienters kohorte indlagt på Clinical Oncology Clinic, National Cancer Institute (NCI), Cairo University, Cairo, Egypten. Mand-til-kvinde 1:1 (30/30) og deres aldersgruppe 24-76 år.

3.2. Kontrolgruppe 28 aldersmatchede og kønsmatchede tilsyneladende raske frivillige, tilfældigt udvalgt blandt forsøgspersoner optaget under normal kontrolundersøgelse eller under bloddonation. Kontrolgruppedeltagerne tog ikke medicin eller led af nogen sygdom. Kontroller aldersgruppen er 40-60 år og 13:15 mand-til-hun. For patientgruppen (n = 60) blev der registreret en fuldstændig historie. Hvis en patient opfyldte inklusionskriterierne, og efter at have givet deres godkendelse til deltagelse i undersøgelsen og underskrevet det informerede samtykke, blev der taget perifere blodprøver på diagnosetidspunktet. Hvis en patient opfyldte eksklusionskriterierne, blev der ikke taget blodprøver. Patientinklusionskriterier var dem, der besøgte koloskopi-enheden til kolorektal undersøgelse og havde en række tyktarmssymptomer, herunder CRC-mærkbare symptomer, forstoppelse, mavesmerter, rektal blødning og pludseligt vægttab. CRC-diagnose blev klinisk bekræftet ved koloskopi, abdominal radio-imaging og histopatologisk undersøgelse. Patienteksklusionskriterier omfattede personer, der modtog kemoterapi, stråling eller blev opereret, patienter med blodsygdomme eller andre kræftformer end CRC. Personer med utilstrækkelige data eller manglende histopatologiske diagnoser, såvel som personer med fjernmetastaser, blev udelukket fra undersøgelsen.

3.2.1. Patienter Patologiske og kliniske data Den kliniske vurdering af CRC-patienters tumor blev foretaget på Patologienheden, NCI, Cairo, Cairo University. Ud over en patienthistorie for kolorektal kirurgi blev den komplette familiehistorie med cancersygdom registreret for alle CRC-deltagere. På NCI blev CRC-stadieinddelingen bestemt af de koloskopiske resultater, abdominal radiografi, patologiske analyser og kliniske beslutninger, baseret på disse resultater og American Joint Committee on Cancer (AJCC) kriterier 2010. Patienterne er kategoriseret i tre stadier; stadium I/II: lokal cancer, stadium III: lokaliseret lymfeknude (LN) involvering (N1-x), og stadium IV: fjernmetastase (M1). LN-involvering med forstørrelseshyppighed som enten ingen (N0) eller tilstedeværende (N1), blev noteret fra patientjournaler. CRC-patienternes familiehistorie, rygestatus, status for ikke-smitsomme sygdomme som diabetes mellitus (DM) og hypertension (HTN) blev registreret. Tumorsted, tumorstørrelse, mucinøs eller ej, lymfeknudemetastase (LNM), tumorinvasion eller vaskulær invasion, tumordifferentiering, tumorgrad, tumor-node-metastase (TNM) stadieinddeling, inflammationsstatus som inflammatorisk tarmsygdom (IBD), CRC placering, hvis colon eller rektal, såvel som hvis transversale, sigmoid, rectosigmoid og rektale, CRC kliniske symptomer, blev vurderet af NCI Biochemical Analysis Unit eller Statistics Unit, indsamlet fra patientfiler. Hæmoglobin (Hgb), protrombintid (PT), erythrocytsedimentationshastighed (ESR), blodpladetal, lymfocyttal, lactatdehydrogenase (LDH), C-reaktivt protein (CRP), blev alle registreret fra patientjournaler udført på NCI, Cairo Egypten, Central Clinical Biochemistry Lab. 4.2. Blodprøver Fem milliliter perifer venøs blodvæskebiopsi blev opsamlet fra den antecubitale vene fra kontroller og CRC-patienter i koagulationsaktivator polymer gel vacutainere. Vacutainere af fuldstændigt koagulerede prøver blev centrifugeret ved 4000 r.p.m. i 10 minutter ved stuetemperatur (25 ◦C). Det opsamlede serum blev alikvoteret og holdt ved -80 ◦C i tre DNase/RNase-fri Eppendorf-rør indtil analyse.

4.3. Total RNA-ekstraktion Total RNA blev ekstraheret fra serumprøver i overensstemmelse med procedureretningslinjerne. Det ekstraherede RNA blev opløst i 40 µL RNase-frit vand og opbevaret i alikvoter ved -80 ◦C.

4.4. Kvantificering af oprenset RNA inklusive miRNA'er Det ekstraherede RNA's renhed og koncentration vurderes ved hjælp af et spektrofotometer. Mængden af ​​RNA i prøven blev vurderet under anvendelse af absorbans ved 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL), og RNA-renheden blev vurderet ved anvendelse af absorbans ved 260/280 nm-forhold.

4.5. Omvendt transkription og ekspressionsmåling af ncRNA'er ved brug af kvantitativ realtids revers transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Real-time (RT2) First Strand Kit blev brugt til komplementær DNA (cDNA) syntese som anvist af producentens instruktioner. Det opnåede cDNA blev opbevaret ved -20 ◦C. Efter omvendt transkription blev qRT-PCR brugt til at måle ekspressionen af ​​lncRNA NNT-AS1 for at evaluere ekspressionsniveauet af lncRNA NNT-AS1, primer RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, kat. nr. 330701) blev brugt, og data blev normaliseret under anvendelse af RT2 lncRNA qPCR-assay for human GAPDH (LPH31725A-200, kat. nr. 330701) som endogen kontrol. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA-syntese blev udført som anvist af procedureretningslinjerne. Det opnåede cDNA blev opbevaret ved -20 ◦C. Efter omvendt transkription blev qRT-PCR brugt til at måle ekspressionen af ​​hsa-miR-485-5p. For at påvise ekspressionsniveauet af hsa-miR-485-5p blev primeren hsa-hsa-miR-485-5p brugt, og data blev normaliseret miRNA PCR-assay (YP00203901, kat. nr. 339306) som endogen kontrol. ncRNA-ekspressionsniveauet som foldændring blev beregnet og normaliseret ved at bruge cyklustærskel (Ct) tilgangen som foldændring (2- ΔΔCt) med GAPDH eller SNORD38B (hsa) som husholdningsgener for lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485 -5p, henholdsvis. ΔCt blev beregnet ved at fratrække Ct-værdierne for GAPDH og SNORD38B (hsa) fra henholdsvis lncRNA NNT-AS1 og hsa-miR-485-5p under undersøgelse.

ΔΔCt = ΔCt cancerprøver - ΔCt kontrolprøver hvor (ΔCt=Ct target - Ct reference) 4.5.3. HSP90-proteinkvantificering ved hjælp af enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) HSP90 blev kvantificeret ved ELISA under anvendelse af det kommercielt tilgængelige kit i henhold til producentens instruktioner. Human HSP90 alpha solid-fase sandwich ELISA måler mængden af ​​target bundet mellem et matchende antistofpar. I brøndene på den medfølgende mikroplade er et målspecifikt antistof blevet præcoatet. I disse brønde binder prøver, standarder eller kontroller til det immobiliserede (fangende) antistof. Sandwichen konstrueres ved at tilføje det andet (detektor) antistof, efterfulgt af tilsætning af en substratopløsning, der interagerer med enzym-antistof-mål-kombinationen for at give et kvantificerbart signal. Dette signals styrke er proportional med koncentrationen af ​​målet i det originale materiale.

4.5.4. CEA- og CA19-9-måling ved elektrokemiluminescensimmunoassay CA19-9- og CEA-serumkoncentrationer blev målt ved anvendelse af et elektrokemiluminescensimmunoassay under anvendelse af Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Nordamerika.

4.5.4.1. Rutinemæssig biokemisk test. Leverfunktionstest: alaninaminotransferase (ALT), aspartataminotransferase (AST) og serumalbumin. Nyrefunktionsindikatorer serum kreatinin og urinstof blev bestemt for alle deltagere.

4.5.5. Forhold og indeks Beregning af kropsmasseindeks (BMI) i kg/m2 blev foretaget for alle deltagerne, hvor normalvægt = 18,5-24,9 kg/m2, overvægt = 25-29,9 kg/m2, og fedme = BMI på 30 kg/m2 eller mere sygelig fedme. Blodplade-til-lymfocytforhold (PLR) er en immunresponsrelateret indikator og systematisk inflammationsbiomarkør, som er overlegen neutrofil-til-lymfocytforholdet for korrelation med den inflammatoriske sygdoms sværhedsgrad.