LncRNA Nicotinamida Nucleotídeo Transidrogenase-Antisense RNA1 NNT-AS1 em CRC

O câncer colorretal (CCR) é uma doença maligna heterogênea que afeta o cólon e o reto. É a terceira doença maligna mais prevalente e letal, com cerca de 1,9 milhões de novos casos e quase 9,4% das mortes relacionadas com o cancro em 2020 em todo o mundo. A taxa de sobrevivência do CCR depende principalmente do estágio da doença no momento do diagnóstico. Assim, a detecção precoce do CCR proporciona uma maior probabilidade de sobrevivência em 5 anos, de 80-90%, em comparação com apenas 14% na fase tardia com metástases à distância. A colonoscopia é o método padrão ouro para o diagnóstico do CCR. Paralelamente à sua grande precisão, é uma técnica invasiva com riscos consideráveis ​​de mortalidade, como perfuração intestinal e hemorragia, limitando a sua utilização para rastreio. Teste de sangue oculto nas fezes, antígeno de carboidrato 19-9 (CA19-9) e antígeno carcinoembrionário (CEA) são os testes de triagem de diagnóstico precoce/marcadores tumorais (TMs) atualmente disponíveis. Embora os testes CEA e CA19-9 sejam simples, não invasivos, acessíveis e seguros, a sua precisão diagnóstica é limitada. O rastreio e o diagnóstico precoce do CCR foram identificados como o factor mais significativo para a redução da mortalidade. RNA não codificante longo (lncRNA), que tem mais de 200 nucleotídeos de RNA não codificante (ncRNAs), é superexpresso ou regulado negativamente em numerosas doenças malignas e atua como potenciais mediadores moleculares para a progressão de vários tumores. Os lncRNAs superexpressos atuam como oncogenes, aumentando a proliferação, apoptose, invasão, metástase e autofagia de células tumorais. Vários lncRNAs têm sido associados à incidência, metástase e resistência terapêutica do CCR. Pesquisas recentes sugeriram que o lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1 (NNT-AS1), que está localizado no cromossomo humano 5p12, está envolvido na regulação da expressão gênica e desempenha papéis importantes em uma variedade de cânceres, como câncer de mama, câncer cervical , carcinoma hepatocelular e osteossarcoma, no entanto, pesquisas insuficientes foram realizadas sobre o papel do lncRNA NNT-AS1 no CCR. MicroRNAs (miRNAs) são pequenos ncRNAs com aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento, que realizam uma variedade de funções biológicas, como proliferação celular, apoptose e angiogênese. As espécies maduras de miRNA, também conhecidas como miRNA-5p (fita guia) e espécie -3p (miRNA passageiro), podem se originar de ambos os braços 5' e 3' do duplex precursor. O braço destinado a ser carregado no complexo silenciador induzido por RNA é a fita guia. Supôs-se que os miRNAs dos passageiros estivessem totalmente destruídos, no entanto, investigações profundas de sequenciamento revelaram que certos miRNAs menores retêm e, de fato, desempenham um papel significativo na regulação genética. Numerosos estudos encontraram uma associação substancial entre a desregulação dos miRs e a metástase tumoral. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p está localizado no cromossomo humano 14q32 e foi identificado como um gene supressor de câncer/tumor em diversas malignidades humanas, através do direcionamento e regulação da expressão de genes de proliferação e invasão celular a jusante. A função reguladora do hsa-miR-485-5p no CRC ainda é indeterminada. A interação LncRNAs-miRs controlaria a incidência e/ou progressão de vários tipos de câncer, além de ser considerada um alvo potencial para futuras invenções de tratamento. Descobriu-se que o LncRNA NNT-AS1 promove a proliferação, migração e invasão do colangiocarcinoma através da esponja hsa-miR-485. Este processo de esponja elevou a β-catenina e a leucemia linfocítica crônica de células B (LLC)/linfoma 9 (BCL9) em resposta. A relação do LncRNA NNT-AS1 com o hsa-miR-485-5p no CRC ainda precisa ser determinada clinicamente. Na maioria das células, em ambientes sem estresse, a proteína de choque térmico 90 (HSP90) são chaperonas moleculares altamente conservadas que constituem 1-2% de todas as proteínas celulares. Funções importantes das proteínas HSP90 incluem dobramento e degradação de proteínas. Fisiologicamente, as interações da chaperona molecular HSP90AB1 com outras co-chaperonas desempenham um papel crucial no dobramento das proteínas recém-geradas ou na estabilização e redobramento de proteínas desnaturadas após estresse, mas, patologicamente, estão envolvidas na tumorigênese. Por exemplo, no osteossarcoma, o hsa-miR-485-5p liga-se ao 3'

-região não traduzida (UTR) do RNA mensageiro (mRNA) HSP90 para reduzir a produção da proteína HSP90, exercendo assim um efeito supressor de tumor. Portanto, pesquisas são necessárias para determinar o significado clínico do eixo lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 em pacientes com CCR.

O presente estudo irá comparar o nível de expressão sanguínea de lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485-5p, bem como os níveis séricos de HSP90 em amostras de sangue periférico de coorte de pacientes egípcios saudáveis ​​e com CRC. Em segundo lugar, examinar se o eixo lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90, ou investigado individualmente, seria usado como biomarcador de precisão molecular não invasivo em biópsia líquida para melhor utilidade diagnóstica para pacientes com CCR. Além disso, com base na estratificação do grupo de pacientes com CCR por graus histológicos 1-3. Finalmente, investigue a provável ligação/correlação entre lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 como um eixo ou individualmente na coorte de pacientes egípcios com CCR em relação a dados demográficos ou características clinicopatológicas. Todas as conclusões serão confirmadas ou descartadas também por meios in silico.

3.1. Grupo de pacientes Um total de 60 pacientes com CCR foram incluídos no estudo. Os pacientes com CCR eram da coorte de pacientes egípcios virgens de tratamento, admitidos na Clínica de Oncologia Clínica, Instituto Nacional do Câncer (NCI), Universidade do Cairo, Cairo, Egito. Homem para mulher 1:1 (30/30) e faixa etária de 24 a 76 anos.

3.2. Grupo controle 28 voluntários aparentemente saudáveis, pareados por idade e sexo, selecionados aleatoriamente de indivíduos alistados durante exame de check-up normal ou durante doação de sangue. Os participantes do grupo controle não faziam uso de nenhum medicamento ou sofriam de alguma doença. A faixa etária dos controles é de 40 a 60 anos e 13h15 de homem para mulher. Para o grupo de pacientes (n = 60) foi registrada uma história completa. Caso o paciente atendesse aos critérios de inclusão e, após aprovação da participação no estudo e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, foram coletadas amostras de sangue periférico no momento do diagnóstico. Se um paciente atendesse aos critérios de exclusão, amostras de sangue não eram coletadas. Os critérios de inclusão de pacientes foram aqueles que visitaram a Unidade de Colonoscopia para exame colorretal e apresentavam uma variedade de sintomas de cólon, incluindo sintomas perceptíveis de CCR, constipação, dor abdominal, sangramento retal e perda súbita de peso. O diagnóstico de CCR foi confirmado clinicamente por colonoscopia, radioimagem abdominal e exame histopatológico. Os critérios de exclusão de pacientes incluíram indivíduos recebendo quimioterapia, radiação ou submetidos a cirurgia, pacientes com doenças sanguíneas ou qualquer câncer que não seja CCR. Foram excluídos do estudo indivíduos com dados inadequados ou falta de diagnóstico histopatológico, bem como aqueles com metástases à distância.

3.2.1. Dados patológicos e clínicos dos pacientes A avaliação clínica do tumor dos pacientes com CCR foi realizada na Unidade de Patologia, NCI, Cairo, Universidade do Cairo. Além do histórico de cirurgia colorretal do paciente, o histórico familiar completo de doença oncológica foi registrado para todos os participantes do CRC. No NCI, o estadiamento do CCR foi determinado pelos resultados da colonoscopia, radiografia abdominal, análises patológicas e decisões clínicas, com base nesses resultados e nos critérios do American Joint Committee on Cancer (AJCC) de 2010. Os pacientes são categorizados em três estágios; estágio I/II: câncer local, estágio III: envolvimento localizado de linfonodo (LN) (N1-x) e estágio IV: metástase à distância (M1). O envolvimento do LN com incidência de aumento como ausente (N0) ou presente (N1) foi anotado nos prontuários dos pacientes. Foram registrados o histórico familiar dos pacientes com CCR, o tabagismo, o status de doenças não transmissíveis como diabetes mellitus (DM) e hipertensão (HA). Local do tumor, tamanho do tumor, mucinoso ou não, metástase linfonodal (LNM), invasão tumoral ou invasão vascular, diferenciação tumoral, grau do tumor, estadiamento tumor-nódulo-metástase (TNM), estado de inflamação como doença inflamatória intestinal (DII), CRC localização se colônico ou retal, bem como se transverso, sigmóide, retossigmóide e retal, sintomas clínicos de CCR, foram avaliados pela Unidade de Análise Bioquímica do NCI ou pela Unidade de Estatística, coletados dos arquivos dos pacientes. Hemoglobina (Hgb), tempo de protrombina (TP), taxa de hemossedimentação (VHS), contagem de plaquetas, contagem de linfócitos, lactato desidrogenase (LDH), proteína C reativa (PCR), foram todos registrados a partir de prontuários de pacientes feitos no NCI, Cairo Egito, Laboratório Central de Bioquímica Clínica. 4.2. Amostras de sangue Cinco mililitros de biópsia líquida de sangue venoso periférico foram coletados da veia antecubital de controles e pacientes com CCR em vacutainers de gel de polímero ativador de coágulo. Vacutainers de amostras completamente coaguladas foram centrifugados a 4.000 rpm por 10 min em temperatura ambiente (25 ◦C). O soro coletado foi dividido em alíquotas e mantido a -80 ◦C em três tubos Eppendorf livres de DNase/RNase até a análise.

4.3. Extração de RNA total O RNA total foi extraído de amostras de soro de acordo com as diretrizes do procedimento. O RNA extraído foi dissolvido em 40 µL de água livre de RNase e armazenado em alíquotas a -80 ◦C.

4.4. Quantificação de RNA purificado incluindo miRNAs A pureza e concentração do RNA extraído são avaliadas usando um espectrofotômetro. A quantidade de RNA na amostra foi avaliada usando absorvância a 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL), e a pureza do RNA foi avaliada usando absorvância em proporções 260/280 nm.

4.5. Transcrição reversa e medição de expressão de ncRNAs usando reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 O kit First Strand em tempo real (RT2) foi usado para síntese de DNA complementar (cDNA), conforme indicado pelas instruções do fabricante. O cDNA obtido foi armazenado a -20 ◦C. Após a transcrição reversa, qRT-PCR foi utilizado para medir a expressão do lncRNA NNT-AS1 para avaliar o nível de expressão do lncRNA NNT-AS1, o primer RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. Nº 330701) e os dados foram normalizados usando RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. Nº 330701) como controle endógeno. 4.5.2. A síntese de cDNA de hsa-miR-485-5p foi realizada conforme orientado pelas diretrizes do procedimento. O cDNA obtido foi armazenado a -20 ◦C. Após a transcrição reversa, o qRT-PCR foi utilizado para medir a expressão do hsa-miR-485-5p. Para detectar o nível de expressão do hsa-miR-485-5p, o iniciador hsa-hsa-miR-485-5p foi utilizado e os dados foram normalizados no miRNA PCR Assay (YP00203901, Cat. Nº 339306) como controle endógeno. O nível de expressão de ncRNA como mudança de dobra foi calculado e normalizado usando a abordagem do limiar do ciclo (Ct) como mudança de dobra (2- ΔΔCt) com GAPDH ou SNORD38B (hsa) como os genes de manutenção para lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485 -5p, respectivamente. ΔCt foi calculado deduzindo os valores de Ct de GAPDH e SNORD38B (hsa) daqueles do lncRNA NNT-AS1 e hsa-miR-485-5p em estudo, respectivamente.

ΔΔCt = ΔCt amostras de cancro - ΔCt amostras de controlo onde (ΔCt=Ct alvo - Ct referência) 4.5.3. Quantificação da proteína HSP90 por ensaio imunoenzimático (ELISA) A HSP90 foi quantificada por ELISA utilizando o kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. O ELISA sanduíche de fase sólida alfa HSP90 humano mede a quantidade de alvo ligado entre um par de anticorpos correspondente. Nos poços da microplaca fornecida, um anticorpo específico do alvo foi pré-revestido. Nestes poços, amostras, padrões ou controlos ligam-se ao anticorpo imobilizado (captura). O sanduíche é construído adicionando o segundo anticorpo (detector), seguido pela adição de uma solução de substrato que interage com a combinação enzima-anticorpo-alvo para fornecer um sinal quantificável. A força deste sinal é proporcional à concentração do alvo no material original.

4.5.4. Medição de CEA e CA19-9 por imunoensaio de eletroquimioluminescência As concentrações séricas de CA19-9 e CEA foram medidas usando um imunoensaio de eletroquimioluminescência usando Cobas® e 602, RocheDiagnostics, North America.

4.5.4.1. Testes bioquímicos de rotina. Testes de função hepática: alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e albumina sérica. Indicadores de função renal creatinina e uréia séricas foram determinados para todos os participantes.

4.5.5. Razões e índices O cálculo do índice de massa corporal (IMC) em kg/m2 foi feito para todos os participantes, onde peso normal = 18,5-24,9 kg/m2, excesso de peso = 25-29,9 kg/m2 e obesidade = IMC de 30 kg/m2 ou maior obesidade mórbida. A relação plaquetas-linfócitos (PLR) é um indicador relacionado à resposta imune e um biomarcador de inflamação sistemática, que é superior à razão neutrófilos-linfócitos para correlação com a gravidade da doença inflamatória.