LncRNA Nikotinamid Nukleotid Transhydrogenas-Antisense RNA1 NNT-AS1 i CRC

Kolorektal cancer (CRC) är en heterogen malignitet som påverkar tjocktarmen och ändtarmen. Det är den tredje vanligaste och dödligaste maligniteten, med ungefär 1,9 miljoner nya fall och nästan 9,4 % av cancerrelaterade dödsfall år 2020 världen över. CRC-överlevnaden beror mest på sjukdomens stadium vid tidpunkten för diagnos. Således ger tidig upptäckt av CRC en högre 5-års överlevnadssannolikhet på 80-90%, jämfört med bara 14% i det sena stadiet med avlägsna metastaser. Koloskopi är guldstandardmetoden för CRC-diagnostik. Vid sidan av sin stora noggrannhet är det en invasiv teknik med betydande dödlighetsrisker, såsom tarmperforering och blödning, vilket begränsar användningen för screening. Fekalt ockult blodprov, kolhydratantigen 19-9 (CA19-9) och karcinoembryonalt antigen (CEA) är de för närvarande tillgängliga CRC-testerna för tidig diagnos av screening/tumörmarkörer (TMs). Även om CEA- och CA19-9-tester är enkla, icke-invasiva, prisvärda och säkra, är deras diagnostiska noggrannhet begränsad. Screening och tidig diagnos för CRC har identifierats som den viktigaste faktorn för att sänka dödligheten. Långt icke-kodande RNA (lncRNA), som är mer än 200 nukleotider icke-kodande RNA (ncRNA), är antingen överuttryckt eller nedreglerat i många maligniteter och fungerar som potentiella molekylära mediatorer för olika tumörprogression. Överuttryckt lncRNA fungerar som onkogener som förstärker tumörcellsproliferation, apoptos, invasion, metastaser och autofagi. Flera lncRNA har kopplats till förekomsten, metastaser och terapeutisk resistens av CRC. Ny forskning tydde på att lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1 (NNT-AS1), som är lokaliserad i den mänskliga kromosomen 5p12, är involverad i reglering av genuttryck och spelar viktiga roller i en mängd olika cancerformer, såsom bröstcancer, livmoderhalscancer , hepatocellulärt karcinom och osteosarkom, dock utfördes otillräcklig forskning om lncRNA NNT-AS1 roll i CRC. MikroRNA (miRNA) är små ncRNA med ~22 nukleotiders längd, som utför en mängd olika biologiska funktioner såsom cellproliferation, apoptos och angiogenes. De mogna miRNA-arterna, även kända som miRNA-5p (guide'-sträng) och -3p-arter (passagerar-miRNA), kan härröra från både 5'- och 3'-armarna av prekursorduplexet. Armen som är avsedd att laddas in i det RNA-inducerade tystande komplexet är guidesträngen. Passagerares miRNA antogs vara helt förstörda, men djupsekvenseringsundersökningar har visat att vissa mindre miRNAs behåller och faktiskt spelar en meningsfull roll i genreglering. Många studier har funnit ett betydande samband mellan miRs dysreglering och tumörmetastaser. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p är belägen på den mänskliga kromosomen 14q32 och har identifierats som en anticancer/tumörsuppressorgen i flera mänskliga maligniteter, genom att rikta in sig på och reglera uttrycket av nedströms cellproliferation och invasionsgener. Den reglerande funktionen av hsa-miR-485-5p i CRC är fortfarande obestämd. LncRNAs-miRs-interaktion skulle kontrollera förekomsten och/eller progressionen av olika cancertyper, samt betraktas som potentiellt mål för framtida behandlingsuppfinning. LncRNA NNT-AS1 befanns främja proliferation, migration och invasion av kolangiokarcinom via sponging hsa-miR-485. Denna svampprocess förhöjde β-catenin och B-cells kronisk lymfatisk leukemi (CLL)/lymfom 9 (BCL9) som svar. LncRNA NNT-AS1s relation till hsa-miR-485-5p i CRC återstår att bestämmas kliniskt. I de flesta celler, under icke-stressinställningar, är värmechockprotein 90 (HSP90) mycket konserverade molekylära chaperoner som utgör 1-2% av alla cellulära proteiner. Viktiga funktioner hos HSP90-proteiner inkluderar proteinveckning och nedbrytning. Fysiologiskt spelar den molekylära chaperonen HSP90AB1-interaktioner med andra co-chaperoner en avgörande roll för veckning av de nygenererade proteinerna eller för att stabilisera och återvecka denaturerade proteiner efter stress, men är patologiskt involverad i tumörbildning. Till exempel, inom osteosarkom, binder hsa-miR-485-5p till 3'

-otranslaterad region (UTR) av HSP90-budbärar-RNA (mRNA) för att minska HSP90-proteinproduktionen, vilket utövar en tumörsuppressoreffekt. Därför är forskning berättigad för att fastställa den kliniska betydelsen av lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-axeln hos CRC-patienter.

Den aktuella studien kommer att jämföra bloduttrycksnivån för lncRNA NNT-AS1 och hsa-miR-485-5p, såväl som HSP90-serumnivåer i både friska och CRC egyptiska patienters perifera kohortblodprover. För det andra, undersök om lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-axeln, eller individuellt undersökt, skulle användas som icke-invasiv molekylär precisionsbiomarkör i flytande biopsi för bättre diagnostisk användbarhet för CRC-patienter. Också baserat på CRC-patienters gruppstratifiering efter histologiska grader 1-3. Slutligen, undersök den troliga kopplingen/korrelationen mellan lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 som en axel eller individuellt i CRC egyptiska patienters kohort i relation till demografiska data eller klinikopatologiska egenskaper. Alla fynd kommer också att bekräftas eller uteslutas med in silico-metoder.

3.1. Patientgrupp Totalt 60 CRC-patienter inkluderades i studien. CRC-patienter var behandlingsnaiva egyptiska patienters kohort som togs in på Clinical Oncology Clinic, National Cancer Institute (NCI), Cairo University, Kairo, Egypten. Man-till-kvinna 1:1 (30/30) och deras åldersintervall 24-76 år.

3.2. Kontrollgrupp 28 åldersmatchade och könsmatchade till synes friska frivilliga, slumpmässigt utvalda från försökspersoner som togs in under normal kontrollundersökning eller under blodgivning. Kontrollgruppsdeltagarna tog inte någon medicin eller led av någon sjukdom. Kontrollens åldersintervall är 40-60 år och 13:15 man-till-kvinna. För patientgruppen (n = 60) registrerades en fullständig historia. Om en patient uppfyllde inklusionskriterierna och efter att ha gett sitt godkännande för deltagande i studien och undertecknat det informerade samtycket, togs perifera blodprover vid diagnostillfället. Om en patient uppfyllde uteslutningskriterierna togs inga blodprover. Patientinklusionskriterier var de som besökte koloskopienheten för kolorektal undersökning och hade en mängd olika kolonsymptom, inklusive märkbara symtom på CRC, förstoppning, buksmärtor, rektal blödning och plötslig viktminskning. CRC-diagnos bekräftades kliniskt genom koloskopi, abdominal radioavbildning och histopatologisk undersökning. Uteslutningskriterier för patienter inkluderade individer som fick kemoterapi, strålning eller genomgått operation, patienter med blodsjukdomar eller någon annan cancer än CRC. Individer med otillräckliga data eller saknade histopatologiska diagnoser, såväl som de med avlägsna metastaser, exkluderades från studien.

3.2.1. Patienter Patologiska och kliniska data Den kliniska bedömningen av CRC-patienters tumör gjordes vid Pathology Unit, NCI, Cairo, Cairo University. Förutom en patienthistoria för kolorektal kirurgi registrerades den fullständiga familjehistoria av cancersjukdom för alla CRC-deltagare. Vid NCI bestämdes CRC-stadieindelningen av koloskopiska resultat, bukröntgen, patologiska analyser och kliniska beslut, baserat på dessa resultat och American Joint Committee on Cancer (AJCC) kriterier 2010. Patienterna kategoriseras i tre stadier; stadium I/II: lokal cancer, stadium III: lymfkörtel (LN) lokaliserad involvering (N1-x), och stadium IV: fjärrmetastaser (M1). LN-inblandning med förstoringsincidens som antingen ingen (N0) eller närvarande (N1), noterades från patientjournaler. CRC-patienternas familjehistoria, rökstatus, status för icke-smittsamma sjukdomar som diabetes mellitus (DM) och hypertoni (HTN) registrerades. Tumörställe, tumörstorlek, mucinös eller inte, lymfkörtelmetastas (LNM), tumörinvasion eller vaskulär invasion, tumördifferentiering, tumörgrad, tumör-nod-metastasering (TNM) stadieindelning, inflammationsstatus som inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), CRC lokalisering om kolon eller rektal, såväl som om transversella, sigmoid, rectosigmoid och rektala, CRC kliniska symptom, bedömdes av NCI Biochemical Analysis Unit eller Statistics Unit, insamlat från patientfiler. Hemoglobin (Hgb), protrombintid (PT), erytrocytsedimentationshastighet (ESR), antal blodplättar, antal lymfocyter, laktatdehydrogenas (LDH), C-reaktivt protein (CRP), alla registrerades från patientjournaler gjorda vid NCI, Kairo Egypten, Central Clinical Biochemistry Lab. 4.2. Blodprov Fem milliliter perifer venös blodvätskebiopsi uppsamlades från den antecubitalvenen från kontroller och CRC-patienter i koagelaktivatorpolymergelvakutainer. Vacutainers av fullständigt koagulerade prover centrifugerades vid 4000 rpm under 10 minuter vid rumstemperatur (25 ◦C). Det uppsamlade serumet delades upp i alikvoter och hölls vid -80 ◦C i tre DNas/RNas-fria Eppendorf-rör fram till analys.

4.3. Total RNA-extraktion Totalt RNA extraherades från serumprover enligt procedurens riktlinjer. Det extraherade RNA:t löstes i 40 µL RNasfritt vatten och lagrades i alikvoter vid -80 ◦C.

4.4. Kvantifiering av renat RNA inklusive miRNA Det extraherade RNA:s renhet och koncentration bedöms med hjälp av en spektrofotometer. Mängden RNA i provet bedömdes med användning av absorbans vid 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL), och RNA-renheten bedömdes med användning av absorbans vid 260/280 nm-förhållanden.

4.5. Omvänd transkription och uttrycksmätning av ncRNA med hjälp av kvantitativ realtid omvänd transkription polymeraskedjereaktion (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Realtids (RT2) First Strand Kit användes för komplementär DNA (cDNA) syntes enligt tillverkarens instruktioner. Det erhållna cDNA:t lagrades vid -20 ◦C. Efter omvänd transkription användes qRT-PCR för att mäta uttrycket av lncRNA NNT-AS1 för att utvärdera expressionsnivån för lncRNA NNT-AS1, primer RT2 lncRNA qPCR-analysen för humant NNT-AS1 (LPH15988A-200, kat. nr 330701) användes och data normaliserades med användning av RT2 lncRNA qPCR-analys för human GAPDH (LPH31725A-200, kat. nr 330701) som endogen kontroll. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA-syntes utfördes enligt instruktionerna för förfarandet. Det erhållna cDNA:t lagrades vid -20 ◦C. Efter omvänd transkription användes qRT-PCR för att mäta uttrycket av hsa-miR-485-5p. För att detektera expressionsnivån för hsa-miR-485-5p användes primern hsa-hsa-miR-485-5p och data normaliserades miRNA PCR-analys (YP00203901, Cat. nr 339306) som endogen kontroll. ncRNA-expressionsnivån som veckförändring beräknades och normaliserades genom att använda cykeltröskeln (Ct)-metoden som fold change (2- ΔΔCt) med GAPDH eller SNORD38B (hsa) som hushållningsgenerna för lncRNA NNT-AS1 och hsa-miR-485 -5p, respektive. ΔCt beräknades genom att dra av Ct-värdena för GAPDH och SNORD38B (hsa) från de av lncRNA NNT-AS1 respektive hsa-miR-485-5p som studerades.

ΔΔCt = ΔCt cancerprover - ΔCt kontrollprover där (ΔCt=Ct mål - Ct referens) 4.5.3. HSP90-proteinkvantifiering med enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) HSP90 kvantifierades med ELISA med användning av det kommersiellt tillgängliga kitet enligt tillverkarens instruktioner. Human HSP90 alfa fastfas sandwich ELISA mäter mängden mål som är bundet mellan ett matchande antikroppspar. I brunnarna på den medföljande mikroplattan har en målspecifik antikropp förbelagts. I dessa brunnar binder prover, standarder eller kontroller till den immobiliserade (infångande) antikroppen. Sandwichen konstrueras genom att tillsätta den andra (detektor) antikroppen, följt av tillsats av en substratlösning som interagerar med enzym-antikropp-målkombinationen för att ge en kvantifierbar signal. Denna signals styrka är proportionell mot koncentrationen av målet i originalmaterialet.

4.5.4. CEA- och CA19-9-mätning med elektrokemiluminescensimmunanalys CA19-9- och CEA-serumkoncentrationer mättes med användning av en elektrokemiluminescensimmunanalys med användning av Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Nordamerika.

4.5.4.1. Rutinmässiga biokemiska tester. Leverfunktionstester: alaninaminotransferas (ALT), aspartataminotransferas (AST) och serumalbumin. Njurfunktionsindikatorer serumkreatinin och urea bestämdes för alla deltagare.

4.5.5. Förhållanden och index Beräkning av kroppsmassaindex (BMI) i kg/m2 gjordes för alla deltagare, där normalvikt = 18,5-24,9 kg/m2, övervikt = 25-29,9 kg/m2 och fetma = BMI på 30 kg/m2 eller mer sjuklig fetma. Trombocyt-till-lymfocyt-förhållandet (PLR) är en immunsvarsrelaterad indikator och systematisk inflammationsbiomarkör, som är överlägsen neutrofil-till-lymfocytförhållandet för korrelation med inflammatorisk sjukdoms svårighetsgrad.