CRC 中的 LncRNA 烟酰胺核苷酸转氢酶反义 RNA1 NNT-AS1

结直肠癌（CRC）是一种影响结肠和直肠的异质性恶性肿瘤。 它是第三大流行和致命的恶性肿瘤，2020 年全球约有 190 万新发病例，占癌症相关死亡人数的近 9.4%。 CRC 存活率主要取决于诊断时疾病的阶段。 因此，早期发现 CRC 的 5 年生存率高达 80-90%，而晚期远处转移的生存率仅为 14%。 结肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准方法。 除了准确性高之外，它还是一种侵入性技术，具有相当大的死亡风险，例如肠穿孔和出血，限制了其筛查的使用。 粪便隐血试验、糖类抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA）是目前可用的CRC早期诊断筛查/肿瘤标志物（TMs）检测。 尽管 CEA 和 CA19-9 检测简单、无创、价格实惠且安全，但其诊断准确性有限。 CRC 筛查和早期诊断已被确定为降低死亡率的最重要因素。 长非编码RNA (lncRNA) 是超过200 个核苷酸的非编码RNA (ncRNA)，在多种恶性肿瘤中过度表达或下调，并作为各种肿瘤进展的潜在分子介质。 过度表达的lncRNA作为癌基因增强肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和自噬。 一些 lncRNA 与 CRC 的发生、转移和治疗耐药有关。 最新研究表明，定位于人类染色体5p12的lncRNA烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1（NNT-AS1）参与基因表达调控，在乳腺癌、宫颈癌等多种癌症中发挥重要作用。然而，lncRNA NNT-AS1 在结直肠癌中的作用研究不足。 MicroRNA (miRNA) 是长度约为 22 个核苷酸的小型 ncRNA，承担多​​种生物学功能，例如细胞增殖、凋亡和血管生成。 成熟的 miRNA 种类，也称为 miRNA-5p（引导链）和 3p 种类（过客 miRNA），可以源自前体双链体的 5' 和 3' 臂。 注定要加载到 RNA 诱导的沉默复合物中的臂是引导链。 乘客 miRNA 被认为被完全破坏，然而，深度测序研究表明，某些次要 miRNA 保留下来，并且实际上在基因调控中发挥着有意义的作用。 大量研究发现 miR 失调与肿瘤转移之间存在显着关联。 智人 (hsa)-miR-485-5p 位于人类染色体 14q32 上，通过靶向和调节下游细胞增殖和侵袭基因的表达，已被确定为多种人类恶性肿瘤的抗癌/肿瘤抑制基因。 hsa-miR-485-5p 在 CRC 中的调节功能尚未确定。 LncRNAs-miRs相互作用将控制各种癌症类型的发生和/或进展，并被认为是未来治疗发明的潜在目标。 研究发现 LncRNA NNT-AS1 通过海绵 hsa-miR-485 促进胆管癌的增殖、迁移和侵袭。 这种海绵过程提高了 β-连环蛋白和 B 细胞慢性淋巴细胞白血病 (CLL)/淋巴瘤 9 (BCL9) 的反应。 LncRNA NNT-AS1 与 CRC 中 hsa-miR-485-5p 的关系仍有待临床确定。 在大多数细胞中，在非应激环境下，热休克蛋白 90 (HSP90) 是高度保守的分子伴侣，占所有细胞蛋白的 1-2%。 HSP90 蛋白的重要功能包括蛋白质折叠和降解。 从生理学上讲，分子伴侣 HSP90AB1 与其他共伴侣的相互作用对于新生成的蛋白质的折叠或在应激后稳定和重折叠变性蛋白质方面发挥着至关重要的作用，但从病理学上来说，它参与了肿瘤发生。 例如，在骨肉瘤中，hsa-miR-485-5p 结合到 3'

-HSP90信使RNA（mRNA）的非翻译区（UTR），减少HSP90蛋白的产生，从而发挥抑癌作用。 因此，有必要进行研究以确定 lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 轴在 CRC 患者中的临床意义。

目前的研究将比较健康和 CRC 埃及患者队列外周血样本中 lncRNA NNT-AS1 和 hsa-miR-485-5p 的血液表达水平以及 HSP90 血清水平。 其次，检查 lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 轴或单独研究是否可用作液体活检中的非侵入性分子精准生物标志物，以更好地诊断 CRC 患者。 此外，还根据 CRC 患者按组织学等级 1-3 进行分组分层。 最后，研究埃及 CRC 患者队列中 lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 作为轴或单独的与人口统计数据或临床病理特征相关的可能联系/相关性。 所有发现也将通过计算机方式得到证实或排除。

3.1. 患者组 共有 60 名 CRC 患者参加了该研究。 结直肠癌患者是埃及开罗大学国家癌症研究所 (NCI) 临床肿瘤诊所收治的未接受过治疗的埃及患者。 男女比例为 1:1 (30/30)，年龄范围为 24-76 岁。

3.2. 对照组28名年龄、性别相匹配的表面健康志愿者，从正常体检或献血期间入组的受试者中随机抽取。 对照组参与者没有服用任何药物或患有任何疾病。 控制年龄范围为40-60岁，男女比例为13:15。 对于患者组（n = 60），记录了完整的病史。 如果患者符合纳入标准，并在同意参加研究并签署知情同意书后，在诊断时采集外周血样本。 如果患者符合排除标准，则不会采集血液样本。 患者纳入标准是那些到结肠镜检查科进行结直肠检查并有各种结肠症状的患者，包括结直肠癌明显症状、便秘、腹痛、直肠出血和体重突然减轻。 CRC 诊断通过结肠镜检查、腹部放射成像和组织病理学检查进行临床证实。 患者排除标准包括接受化疗、放疗或接受手术的个体、患有血液疾病或除结直肠癌以外的任何癌症的患者。 数据不足或缺少组织病理学诊断的个体以及有远处转移的个体被排除在研究之外。

3.2.1. 患者病理和临床数据 CRC 患者肿瘤的临床评估是在开罗大学 NCI 病理学部门进行的。 除了患者结直肠手术史外，还记录了所有 CRC 参与者的完整癌症家族史。 在 NCI，CRC 分期是根据结肠镜检查结果、腹部 X 光检查、病理分析和临床决策确定的，并依据这些结果和美国癌症联合委员会 (AJCC) 2010 年标准。 患者分为三个阶段； I/II期：局部癌症，III期：淋巴结（LN）局部受累（N1-x），IV期：远处转移（M1）。 从患者档案中可以看出，淋巴结受累伴肿大的发生率为无（N0）或存在（N1）。 记录CRC患者家族史、吸烟状况、糖尿病（DM）和高血压（HTN）等非传染性疾病状况。 肿瘤部位、肿瘤大小、是否为粘液性、淋巴结转移 (LNM)、肿瘤侵袭或血管侵袭、肿瘤分化、肿瘤分级、肿瘤-淋巴结-转移 (TNM) 分期、炎症状态为炎症性肠病 (IBD)、CRC NCI 生化分析单位或统计单位从患者档案中收集，评估结肠或直肠的位置，以及横切、乙状结肠、直肠乙状结肠和直肠的 CRC 临床症状。 血红蛋白 (Hgb)、凝血酶原时间 (PT)、红细胞沉降率 (ESR)、血小板计数、淋巴细胞计数、乳酸脱氢酶 (LDH)、C 反应蛋白 (CRP) 均记录于开罗 NCI 的患者档案中埃及，中央临床生物化学实验室。 4.2. 血液样本从对照者和CRC患者的肘前静脉收集5毫升外周静脉血液体活检到凝块激活剂聚合物凝胶真空采血管中。 将完全凝固的样品用真空采血管在室温 (25°C) 下以 4000 转/分的速度离心 10 分钟。 将收集的血清等分并保存在三个无 DNase/RNase 的 Eppendorf 管中，直至分析。

4.3. 总RNA提取 根据程序指南从血清样品中提取总RNA。 将提取的 RNA 溶解在 40 µL 无 RNase 水中，并分装在 - 80 ℃ 下保存。

4.4. 纯化 RNA（包括 miRNA）的定量 使用分光光度计评估提取的 RNA 的纯度和浓度。 使用 260 nm 处的吸光度 (A260 = 1 → 44 ng/μL) 评估样品中 RNA 的量，并使用 260/280 nm 比率的吸光度评估 RNA 纯度。

4.5. 使用定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行 ncRNA 的逆转录和表达测量 4.5.1。 lncRNA NNT-AS1 按照制造商的说明，使用实时 (RT2) 第一链试剂盒进行互补 DNA (cDNA) 合成。 获得的 cDNA 保存于 - 20 ℃。 逆转录后，利用qRT-PCR测量lncRNA NNT-AS1的表达，以评估lncRNA NNT-AS1的表达水平，引物RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1（LPH15988A-200，Cat. 1）。 使用人 GAPDH 的 RT2 lncRNA qPCR 检测（LPH31725A-200，目录号 330701）对数据进行标准化。 编号 330701）作为内源对照。 4.5.2. 按照程序指南的指示进行 hsa-miR-485-5p cDNA 合成。 获得的 cDNA 保存于 - 20 ℃。 逆转录后，利用qRT-PCR测量hsa-miR-485-5p的表达。 为了检测 hsa-miR-485-5p 的表达水平，使用引物 hsa-hsa-miR-485-5p 并对数据进行归一化 miRNA PCR 测定（YP00203901，Cat. 编号 339306）作为内源对照。 使用循环阈值 (Ct) 方法计算 ncRNA 表达水平的倍数变化，并将其归一化为倍数变化 (2-ΔΔCt)，其中 GAPDH 或 SNORD38B (hsa) 作为 lncRNA NNT-AS1 和 hsa-miR-485 的管家基因分别为-5p。 ΔCt是通过分别从所研究的lncRNA NNT-AS1和hsa-miR-485-5p的Ct值中扣除GAPDH和SNORD38B（hsa）的Ct值来计算的。

ΔΔCt = ΔCt 癌症样品 - ΔCt 对照样品，其中（ΔCt=Ct 目标 - Ct 参考） 4.5.3。 通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行HSP90蛋白定量 根据制造商的说明，使用市售试剂盒通过ELISA对HSP90进行定量。 人类 HSP90 α 固相夹心 ELISA 可测量匹配抗体对之间结合的靶标量。 在提供的微孔板的孔中，已预先包被了靶标特异性抗体。 在这些孔中，样品、标准品或对照与固定（捕获）抗体结合。 通过添加第二（检测）抗体，然后添加与酶-抗体-靶标组合相互作用以给出可量化信号的底物溶液来构建夹心结构。 该信号的强度与原始材料中目标的浓度成正比。

4.5.4. 通过电化学发光免疫测定法测量 CEA 和 CA19-9 使用 Cobas® e 602（RocheDiagnostics，北美）通过电化学发光免疫测定法测量 CA19-9 和 CEA 血清浓度。

4.5.4.1. 常规生化检测。 肝功能检查：丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和血清白蛋白。 测定了所有参与者的肾功能指标血清肌酐和尿素。

4.5.5。 比率和指数 对所有参与者进行体重指数 (BMI) 计算（以 kg/m2 为单位），其中正常体重 = 18.5-24.9 kg/m2，超重=25-29.9 kg/m2 ，肥胖 = BMI 为 30 kg/m2 或更高的病态肥胖。 血小板与淋巴细胞比值（PLR）是一种免疫反应相关指标和系统性炎症生物标志物，与炎症疾病严重程度的相关性优于中性粒细胞与淋巴细胞比值。