LncRNA-Nikotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase-Antisense-RNA1 NNT-AS1 in CRC

Darmkrebs (CRC) ist eine heterogene bösartige Erkrankung, die den Dickdarm und das Rektum betrifft. Mit rund 1,9 Millionen Neuerkrankungen und fast 9,4 % der krebsbedingten Todesfälle im Jahr 2020 weltweit ist es die dritthäufigste und tödlichste bösartige Erkrankung. Die CRC-Überlebensrate hängt hauptsächlich vom Stadium der Krankheit zum Zeitpunkt der Diagnose ab. Somit bietet die Früherkennung von Darmkrebs eine höhere 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit von 80–90 %, verglichen mit nur 14 % im Spätstadium mit Fernmetastasen. Die Koloskopie ist die Goldstandardmethode zur CRC-Diagnose. Abgesehen von ihrer hohen Genauigkeit handelt es sich um eine invasive Technik mit erheblichen Sterblichkeitsrisiken wie Darmperforation und Blutungen, was ihre Verwendung für das Screening einschränkt. Der Test auf okkultes Blut im Stuhl, das Kohlenhydrat-Antigen 19-9 (CA19-9) und das karzinoembryonale Antigen (CEA) sind die derzeit verfügbaren CRC-Früherkennungstests/Tumormarkertests (TMs). Obwohl CEA- und CA19-9-Tests einfach, nicht-invasiv, erschwinglich und sicher sind, ist ihre diagnostische Genauigkeit begrenzt. Screening und frühzeitige Diagnose von Darmkrebs wurden als wichtigste Faktoren für die Senkung der Mortalität identifiziert. Lange nicht-kodierende RNA (lncRNA), bei der es sich um mehr als 200 Nukleotide nicht-kodierende RNA (ncRNA) handelt, wird bei zahlreichen bösartigen Erkrankungen entweder überexprimiert oder herunterreguliert und fungiert als potenzielle molekulare Mediatoren für das Fortschreiten verschiedener Tumoren. Überexprimierte lncRNAs wirken als Onkogene und verstärken die Proliferation, Apoptose, Invasion, Metastasierung und Autophagie von Tumorzellen. Mehrere lncRNAs wurden mit der Inzidenz, Metastasierung und Therapieresistenz von CRC in Verbindung gebracht. Jüngste Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die lncRNA-Nikotinamid-Nukleotid-Transhydrogenase-Antisense-RNA1 (NNT-AS1), die im menschlichen Chromosom 5p12 lokalisiert ist, an der Regulierung der Genexpression beteiligt ist und eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Krebsarten wie Brustkrebs und Gebärmutterhalskrebs spielt , hepatozelluläres Karzinom und Osteosarkom, es wurden jedoch nur unzureichende Untersuchungen zur Rolle von lncRNA NNT-AS1 bei CRC durchgeführt. MicroRNAs (miRNAs) sind kleine ncRNAs mit einer Länge von ca. 22 Nukleotiden, die eine Vielzahl biologischer Funktionen wie Zellproliferation, Apoptose und Angiogenese übernehmen. Die reifen miRNA-Spezies, auch bekannt als miRNA-5p (Guide-Strang) und -3p-Spezies (Passagier-miRNA), können sowohl vom 5'- als auch vom 3'-Arm des Vorläufer-Duplex stammen. Der Arm, der in den RNA-induzierten Silencing-Komplex geladen werden soll, ist der Führungsstrang. Es wurde angenommen, dass die Passagier-miRNAs vollständig zerstört wurden. Tiefgreifende Sequenzierungsuntersuchungen haben jedoch gezeigt, dass bestimmte kleinere miRNAs erhalten bleiben und tatsächlich eine bedeutende Rolle bei der Genregulation spielen. Zahlreiche Studien haben einen erheblichen Zusammenhang zwischen der Fehlregulation von miRs und der Tumormetastasierung festgestellt. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p befindet sich auf dem menschlichen Chromosom 14q32 und wurde als Antikrebs-/Tumorsuppressorgen bei mehreren bösartigen Erkrankungen des Menschen identifiziert, indem es auf die Expression nachgeschalteter Zellproliferations- und Invasionsgene abzielt und diese reguliert. Die regulatorische Funktion von hsa-miR-485-5p bei CRC ist noch ungeklärt. Die LncRNAs-miRs-Interaktion würde die Inzidenz und/oder das Fortschreiten verschiedener Krebsarten kontrollieren und als potenzielles Ziel für zukünftige Behandlungserfindungen angesehen werden. Es wurde festgestellt, dass LncRNA NNT-AS1 die Proliferation, Migration und Invasion von Cholangiokarzinomen über das Sponging von hsa-miR-485 fördert. Dieser Schwammprozess erhöhte als Reaktion darauf β-Catenin und B-Zell-chronische lymphatische Leukämie (CLL)/Lymphom 9 (BCL9). Die Beziehung von LncRNA NNT-AS1 zu hsa-miR-485-5p bei CRC muss noch klinisch bestimmt werden. In den meisten Zellen sind Hitzeschockprotein 90 (HSP90) unter stressfreien Bedingungen hochkonservierte molekulare Chaperone, die 1–2 % aller zellulären Proteine ​​ausmachen. Zu den wichtigen Funktionen von HSP90-Proteinen gehören die Proteinfaltung und der Proteinabbau. Physiologisch gesehen spielen die Interaktionen des molekularen Chaperons HSP90AB1 mit anderen Co-Chaperonen eine entscheidende Rolle bei der Faltung der neu erzeugten Proteine ​​oder bei der Stabilisierung und Rückfaltung denaturierter Proteine ​​nach Stress, sind aber pathologisch an der Tumorentstehung beteiligt. Beispielsweise bindet hsa-miR-485-5p im Osteosarkom an die 3'

-untranslatierte Region (UTR) der HSP90-Messenger-RNA (mRNA), um die HSP90-Proteinproduktion zu reduzieren und somit eine tumorsuppressive Wirkung auszuüben. Daher sind Forschungsarbeiten erforderlich, um die klinische Bedeutung der lncRNA-NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-Achse bei CRC-Patienten zu bestimmen.

In der aktuellen Studie werden die Blutexpressionsniveaus von lncRNA NNT-AS1 und hsa-miR-485-5p sowie die HSP90-Serumspiegel in peripheren Blutproben der Kohorte gesunder und ägyptischer CRC-Patienten verglichen. Zweitens: Untersuchen Sie, ob die lncRNA-Achse NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 oder einzeln untersucht als nicht-invasiver molekularer Präzisionsbiomarker in der Flüssigbiopsie für einen besseren diagnostischen Nutzen für CRC-Patienten verwendet werden könnte. Außerdem basierend auf der Gruppenstratifizierung der CRC-Patienten nach histologischen Grad 1–3. Untersuchen Sie abschließend die wahrscheinliche Verbindung/Korrelation zwischen lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 als Achse oder einzeln in der Kohorte ägyptischer CRC-Patienten in Bezug auf demografische Daten oder klinisch-pathologische Merkmale. Alle Befunde werden auch in silico bestätigt oder ausgeschlossen.

3.1. Patientengruppe Insgesamt wurden 60 CRC-Patienten in die Studie aufgenommen. Bei den CRC-Patienten handelte es sich um eine Kohorte behandlungsnaiver ägyptischer Patienten, die in der Clinical Oncology Clinic des National Cancer Institute (NCI) der Universität Kairo, Kairo, Ägypten, aufgenommen wurden. Mann-zu-Frau 1:1 (30/30) und ihre Altersspanne liegt zwischen 24 und 76 Jahren.

3.2. Kontrollgruppe: 28 offensichtlich gesunde Freiwillige mit gleichem Alter und gleichem Geschlecht, zufällig ausgewählt aus Probanden, die während der normalen Kontrolluntersuchung oder während der Blutspende rekrutiert wurden. Die Teilnehmer der Kontrollgruppe nahmen keine Medikamente ein und litten an keiner Krankheit. Die Altersspanne der Kontrollen liegt zwischen 40 und 60 Jahren und das Verhältnis von Mann zu Frau beträgt 13:15. Für die Patientengruppe (n = 60) wurde eine vollständige Anamnese erfasst. Wenn ein Patient die Einschlusskriterien erfüllte und nach seiner Zustimmung zur Teilnahme an der Studie und der Unterzeichnung der Einverständniserklärung zum Zeitpunkt der Diagnose periphere Blutproben entnommen wurden. Wenn ein Patient die Ausschlusskriterien erfüllte, wurden keine Blutproben entnommen. Einschlusskriterien für Patienten waren diejenigen, die die Koloskopieabteilung zur kolorektalen Untersuchung aufsuchten und eine Vielzahl von Dickdarmsymptomen aufwiesen, darunter auffällige Darmkrebssymptome, Verstopfung, Bauchschmerzen, rektale Blutungen und plötzlicher Gewichtsverlust. Die CRC-Diagnose wurde klinisch durch Koloskopie, Röntgenbildgebung des Abdomens und histopathologische Untersuchung bestätigt. Zu den Ausschlusskriterien für Patienten gehörten Personen, die eine Chemotherapie oder Bestrahlung erhielten oder sich einer Operation unterzogen hatten, Patienten mit Bluterkrankungen oder anderen Krebsarten als CRC. Personen mit unzureichenden Daten oder fehlenden histopathologischen Diagnosen sowie Personen mit Fernmetastasen wurden von der Studie ausgeschlossen.

3.2.1. Pathologische und klinische Daten der Patienten Die klinische Beurteilung des Tumors von CRC-Patienten wurde in der Pathologieabteilung des NCI der Universität Kairo durchgeführt. Zusätzlich zur Vorgeschichte einer kolorektalen Operation des Patienten wurde für alle CRC-Teilnehmer die vollständige Familienanamnese einer Krebserkrankung erfasst. Am NCI wurde das CRC-Stadieneinteilung anhand der koloskopischen Ergebnisse, der Röntgenaufnahme des Abdomens, pathologischen Analysen und klinischen Entscheidungen bestimmt und stützte sich dabei auf diese Ergebnisse und die Kriterien des American Joint Committee on Cancer (AJCC) von 2010. Die Patienten werden in drei Stadien eingeteilt; Stadium I/II: lokaler Krebs, Stadium III: lokalisierte Lymphknotenbeteiligung (N1-x) und Stadium IV: Fernmetastasierung (M1). Aus den Patientenakten wurde eine LN-Beteiligung mit Vergrößerungsinzidenz als entweder „nein“ (N0) oder „vorhanden“ (N1) vermerkt. Die Familiengeschichte der CRC-Patienten, der Raucherstatus und der Status nichtübertragbarer Krankheiten wie Diabetes mellitus (DM) und Bluthochdruck (HTN) wurden aufgezeichnet. Tumorlokalisation, Tumorgröße, schleimig oder nicht, Lymphknotenmetastasierung (LNM), Tumorinvasion oder Gefäßinvasion, Tumordifferenzierung, Tumorgrad, Tumorknotenmetastasierungsstadium (TNM), Entzündungsstatus als entzündliche Darmerkrankung (IBD), CRC Die Lokalisation der klinischen Darmkrebs-Symptome, ob im Dickdarm oder im Rektum, sowie im Quer-, Sigma-, Rektosigmoid- und Rektalbereich, wurde von der NCI Biochemical Analysis Unit oder der Statistics Unit anhand von Patientenakten beurteilt. Hämoglobin (Hgb), Prothrombinzeit (PT), Erythrozytensedimentationsrate (ESR), Thrombozytenzahl, Lymphozytenzahl, Laktatdehydrogenase (LDH) und C-reaktives Protein (CRP) wurden alle aus Patientenakten des NCI in Kairo erfasst Ägypten, Zentrallabor für klinische Biochemie. 4.2. Blutproben Fünf Milliliter Flüssigkeitsbiopsie des peripheren venösen Blutes wurden aus der Vena antecubitalis von Kontrollpersonen und CRC-Patienten in Gerinnungsaktivator-Polymer-Gel-Vakutainern gesammelt. Vakuumbehälter vollständig geronnener Proben wurden 10 Minuten lang bei 4000 U/min bei Raumtemperatur (25 °C) zentrifugiert. Das gesammelte Serum wurde aliquotiert und bis zur Analyse in drei DNase/RNase-freien Eppendorf-Röhrchen bei -80 °C aufbewahrt.

4.3. Gesamt-RNA-Extraktion Die Gesamt-RNA wurde gemäß den Verfahrensrichtlinien aus Serumproben extrahiert. Die extrahierte RNA wurde in 40 µL RNase-freiem Wasser gelöst und in Aliquots bei -80 °C gelagert.

4.4. Quantifizierung der gereinigten RNA einschließlich miRNAs. Die Reinheit und Konzentration der extrahierten RNA werden mit einem Spektrophotometer beurteilt. Die RNA-Menge in der Probe wurde anhand der Absorption bei 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL) und die RNA-Reinheit anhand der Absorptionsverhältnisse bei 260/280 nm beurteilt.

4.5. Reverse Transkription und Expressionsmessung von ncRNAs mittels quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Das Echtzeit-First-Strang-Kit (RT2) wurde für die Synthese komplementärer DNA (cDNA) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die erhaltene cDNA wurde bei -20 °C gelagert. Nach der umgekehrten Transkription wurde qRT-PCR verwendet, um die Expression der lncRNA NNT-AS1 zu messen und das Expressionsniveau der lncRNA NNT-AS1 zu bewerten. Der Primer-RT2-lncRNA-qPCR-Assay für menschliches NNT-AS1 (LPH15988A-200, Kat. 330701) wurde verwendet und die Daten wurden mit dem RT2 lncRNA qPCR Assay für Human GAPDH (LPH31725A-200, Kat. Nr. 330701) normalisiert. Nr. 330701) als endogene Kontrolle. 4.5.2. Die hsa-miR-485-5p-cDNA-Synthese wurde gemäß den Verfahrensrichtlinien durchgeführt. Die erhaltene cDNA wurde bei -20 °C gelagert. Nach der umgekehrten Transkription wurde qRT-PCR verwendet, um die Expression von hsa-miR-485-5p zu messen. Um das Expressionsniveau von hsa-miR-485-5p zu ermitteln, wurde der Primer hsa-hsa-miR-485-5p verwendet und die Daten wurden im miRNA PCR Assay normalisiert (YP00203901, Kat. Nr. 339306) als endogene Kontrolle. Das ncRNA-Expressionsniveau als Fold-Change wurde unter Verwendung des Zyklusschwellenwertansatzes (Ct) als Fold-Change (2-ΔΔCt) mit GAPDH oder SNORD38B (hsa) als Housekeeping-Genen für lncRNA NNT-AS1 und hsa-miR-485 berechnet und normalisiert -5p bzw. ΔCt wurde berechnet, indem die Ct-Werte von GAPDH und SNORD38B (hsa) von denen der untersuchten lncRNA NNT-AS1 bzw. hsa-miR-485-5p abgezogen wurden.

ΔΔCt = ΔCt-Krebsproben – ΔCt-Kontrollproben, wobei (ΔCt=Ct-Ziel – Ct-Referenz) 4.5.3. Quantifizierung des HSP90-Proteins mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Das HSP90 wurde mittels ELISA unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Der humane HSP90-Alpha-Festphasen-Sandwich-ELISA misst die Menge des zwischen einem passenden Antikörperpaar gebundenen Ziels. In den Vertiefungen der mitgelieferten Mikroplatte ist ein zielspezifischer Antikörper vorbeschichtet. In diesen Vertiefungen binden Proben, Standards oder Kontrollen an den immobilisierten (Fänger-)Antikörper. Das Sandwich wird durch Zugabe des zweiten (Detektor-)Antikörpers und anschließender Zugabe einer Substratlösung aufgebaut, die mit der Enzym-Antikörper-Ziel-Kombination interagiert und ein quantifizierbares Signal liefert. Die Stärke dieses Signals ist proportional zur Konzentration des Ziels im Originalmaterial.

4.5.4. CEA- und CA19-9-Messung durch Elektrochemilumineszenz-Immunoassay. Die CA19-9- und CEA-Serumkonzentrationen wurden mithilfe eines Elektrochemilumineszenz-Immunoassays unter Verwendung von Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Nordamerika, gemessen.

4.5.4.1. Routinemäßige biochemische Tests. Leberfunktionstests: Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST) und Serumalbumin. Bei allen Teilnehmern wurden die Nierenfunktionsindikatoren Serumkreatinin und Harnstoff bestimmt.

4.5.5. Verhältnisse und Indizes Die Berechnung des Body-Mass-Index (BMI) in kg/m2 erfolgte für alle Teilnehmer mit einem Normalgewicht von 18,5–24,9 kg/m2, Übergewicht = 25-29,9 kg/m2 und Fettleibigkeit = BMI von 30 kg/m2 oder mehr krankhafte Fettleibigkeit. Das Verhältnis von Blutplättchen zu Lymphozyten (PLR) ist ein immunantwortbezogener Indikator und systematischer Entzündungsbiomarker, der hinsichtlich der Korrelation mit der Schwere der entzündlichen Erkrankung dem Verhältnis von Neutrophilen zu Lymphozyten überlegen ist.