LncRNA Nicotinamide Nucléotide Transhydrogénase-Antisens ARN1 NNT-AS1 dans le CCR

Le cancer colorectal (CCR) est une tumeur maligne hétérogène qui touche le côlon et le rectum. Il s’agit de la troisième tumeur maligne la plus répandue et la plus mortelle, avec environ 1,9 million de nouveaux cas et près de 9,4 % des décès liés au cancer en 2020 dans le monde. Le taux de survie du CCR dépend principalement du stade de la maladie au moment du diagnostic. Ainsi, la détection précoce du CCR offre une probabilité de survie à 5 ans plus élevée, de 80 à 90 %, contre seulement 14 % au stade avancé avec des métastases à distance. La coloscopie est la méthode de référence pour le diagnostic du CCR. Outre sa grande précision, il s’agit d’une technique invasive comportant des risques de mortalité considérables, tels que des perforations intestinales et des saignements, limitant son utilisation pour le dépistage. Le test de sang occulte dans les selles, l'antigène glucidique 19-9 (CA19-9) et l'antigène carcinoembryonnaire (CEA) sont les tests de dépistage de diagnostic précoce/marqueurs tumoraux (TM) actuellement disponibles. Bien que les tests CEA et CA19-9 soient simples, non invasifs, abordables et sûrs, leur précision diagnostique est limitée. Le dépistage et le diagnostic précoce du CCR ont été identifiés comme le facteur le plus important pour réduire la mortalité. Les ARN longs non codants (lncRNA), qui contiennent plus de 200 nucléotides non codants (ncRNA), sont soit surexprimés, soit sous-régulés dans de nombreuses tumeurs malignes et agissent comme médiateurs moléculaires potentiels pour la progression de diverses tumeurs. Les ARNnc surexprimés agissent comme des oncogènes améliorant la prolifération des cellules tumorales, l'apoptose, l'invasion, les métastases et l'autophagie. Plusieurs lncRNA ont été associés à l’incidence, aux métastases et à la résistance thérapeutique du CCR. Des recherches récentes suggèrent que l'ARN1 lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisens (NNT-AS1), localisé dans le chromosome humain 5p12, est impliqué dans la régulation de l'expression génique et joue un rôle important dans divers cancers, tels que le cancer du sein, le cancer du col de l'utérus. , le carcinome hépatocellulaire et l'ostéosarcome, cependant, des recherches insuffisantes ont été menées sur le rôle de l'ARNnc NNT-AS1 dans le CCR. Les microARN (miARN) sont de petits ARNnc d'une longueur d'environ 22 nucléotides, qui assument diverses fonctions biologiques telles que la prolifération cellulaire, l'apoptose et l'angiogenèse. Les espèces de miARN matures, également connues sous le nom d'espèces miARN-5p (brin guide) et - 3p (miARN passager), peuvent provenir à la fois des bras 5' et 3' du duplex précurseur. Le bras destiné à être chargé dans le complexe de silençage induit par l’ARN est le brin guide. On pensait que les miARN passagers étaient entièrement détruits. Cependant, des études de séquençage approfondies ont révélé que certains miARN mineurs conservent et jouent en fait un rôle significatif dans la régulation des gènes. De nombreuses études ont trouvé une association substantielle entre la dérégulation des miR et les métastases tumorales. Homo sapiens (hsa) -miR-485-5p est situé sur le chromosome humain 14q32 et a été identifié comme un gène anticancéreux/suppresseur de tumeur dans plusieurs tumeurs malignes humaines, en ciblant et en régulant l'expression des gènes de prolifération et d'invasion cellulaires en aval. La fonction régulatrice du hsa-miR-485-5p dans le CRC est encore indéterminée. L’interaction LncRNA-miR contrôlerait l’incidence et/ou la progression de divers types de cancer, tout en étant considérée comme une cible potentielle pour une future invention de traitement. Il a été constaté que le LncRNA NNT-AS1 favorise la prolifération, la migration et l'invasion du cholangiocarcinome via l'épongage hsa-miR-485. Ce processus d’épongement a augmenté la β-caténine et la leucémie lymphoïde chronique (LLC)/lymphome 9 (BCL9) à cellules B en réponse. La relation entre LncRNA NNT-AS1 et hsa-miR-485-5p dans le CCR reste à déterminer cliniquement. Dans la plupart des cellules, dans des conditions sans stress, la protéine de choc thermique 90 (HSP90) est un chaperon moléculaire hautement conservé qui représente 1 à 2 % de toutes les protéines cellulaires. Les fonctions importantes des protéines HSP90 comprennent le repliement et la dégradation des protéines. Physiologiquement, les interactions du chaperon moléculaire HSP90AB1 avec d'autres co-chaperons jouent un rôle crucial dans le repliement des protéines nouvellement générées ou dans la stabilisation et le repliement des protéines dénaturées suite à un stress, mais, pathologiquement, elles sont impliquées dans la tumorigenèse. Par exemple, dans l'ostéosarcome, hsa-miR-485-5p se lie au 3'

-région non traduite (UTR) de l'ARN messager (ARNm) de HSP90 pour réduire la production de protéine HSP90, exerçant ainsi un effet suppresseur de tumeur. Par conséquent, des recherches sont justifiées pour déterminer la signification clinique de l’axe lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 chez les patients atteints de CCR.

L'étude actuelle comparera le niveau d'expression sanguine de lncRNA NNT-AS1 et hsa-miR-485-5p, ainsi que les niveaux sériques de HSP90 dans les échantillons de sang périphérique de la cohorte de patients égyptiens en bonne santé et CRC. Deuxièmement, examinez si l'axe lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90, ou étudié individuellement, serait utilisé comme biomarqueur de précision moléculaire non invasif dans la biopsie liquide pour une meilleure utilité diagnostique pour les patients atteints de CCR. Également basé sur la stratification des groupes de patients atteints de CCR par grades histologiques 1 à 3. Enfin, étudiez le lien/corrélation probable entre lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 en tant qu'axe ou individuellement dans la cohorte de patients égyptiens CCR par rapport aux données démographiques ou aux caractéristiques clinicopathologiques. Tous les résultats seront également confirmés ou infirmés par des moyens in silico.

3.1. Groupe de patients Au total, 60 patients atteints de CCR ont été inscrits dans l'étude. Les patients atteints de CCR étaient une cohorte de patients égyptiens naïfs de traitement admis à la clinique d'oncologie clinique de l'Institut national du cancer (NCI), Université du Caire, Le Caire, Égypte. Hommes-femmes 1:1 (30/30) et tranche d’âge de 24 à 76 ans.

3.2. Groupe témoin 28 volontaires apparemment en bonne santé du même âge et du même sexe, sélectionnés au hasard parmi les sujets enrôlés lors d'un examen de contrôle normal ou lors d'un don de sang. Les participants du groupe témoin ne prenaient aucun médicament et ne souffraient d’aucune maladie. La tranche d’âge des contrôles est de 40 à 60 ans et de 13h15 d’homme à femme. Pour le groupe de patients (n = 60), un historique complet a été enregistré. Si un patient répondait aux critères d'inclusion et, après avoir donné son approbation pour participer à l'étude et signé le consentement éclairé, des échantillons de sang périphérique étaient prélevés au moment du diagnostic. Si un patient répondait aux critères d’exclusion, aucun échantillon de sang n’était prélevé. Les critères d'inclusion des patients étaient ceux qui se rendaient à l'unité de coloscopie pour un examen colorectal et présentaient divers symptômes du côlon, notamment des symptômes visibles de CCR, de la constipation, des douleurs abdominales, des saignements rectaux et une perte de poids soudaine. Le diagnostic de CCR a été confirmé cliniquement par coloscopie, radio-imagerie abdominale et examen histopathologique. Les critères d'exclusion des patients incluaient les personnes recevant une chimiothérapie, une radiothérapie ou ayant subi une intervention chirurgicale, les patients souffrant de troubles sanguins ou de tout cancer autre que le CCR. Les personnes disposant de données insuffisantes ou de diagnostics histopathologiques manquants, ainsi que celles présentant des métastases à distance, ont été exclues de l'étude.

3.2.1. Données pathologiques et cliniques des patients L'évaluation clinique de la tumeur des patients atteints de CCR a été réalisée à l'unité de pathologie, NCI, Le Caire, Université du Caire. En plus des antécédents de chirurgie colorectale du patient, les antécédents familiaux complets de cancer ont été enregistrés pour tous les participants au CRC. Au NCI, la stadification du CCR a été déterminée par les résultats coloscopiques, la radiographie abdominale, les analyses pathologiques et les décisions cliniques, en s'appuyant sur ces résultats et sur les critères 2010 de l'American Joint Committee on Cancer (AJCC). Les patients sont classés en trois étapes : stade I/II : cancer local, stade III : atteinte localisée des ganglions lymphatiques (LN) (N1-x) et stade IV : métastases à distance (M1). L'implication du LN avec une incidence d'élargissement soit nulle (N0) soit présente (N1) a été notée dans les dossiers des patients. Les antécédents familiaux des patients atteints de CCR, leur statut tabagique, leur statut en matière de maladies non transmissibles telles que le diabète sucré (DM) et l'hypertension (HTN) ont été enregistrés. Site tumoral, taille de la tumeur, mucineuse ou non, métastases ganglionnaires (LNM), invasion tumorale ou invasion vasculaire, différenciation tumorale, grade de la tumeur, stade des métastases ganglionnaires tumorales (TNM), état inflammatoire en tant que maladie inflammatoire de l'intestin (MII), CCR l'emplacement s'il est colique ou rectal, ainsi que s'il est transversal, sigmoïde, rectosigmoïde et rectal, les symptômes cliniques du CCR ont été évalués par l'unité d'analyse biochimique du NCI ou l'unité de statistiques, collectées à partir des dossiers des patients. L'hémoglobine (Hgb), le temps de prothrombine (PT), la vitesse de sédimentation des érythrocytes (ESR), la numération plaquettaire, la numération lymphocytaire, la lactate déshydrogénase (LDH), la protéine C-réactive (CRP), ont tous été enregistrés à partir des dossiers des patients établis au NCI du Caire. Égypte, Laboratoire central de biochimie clinique. 4.2. Échantillons de sang Cinq millilitres de biopsie liquide de sang veineux périphérique ont été prélevés dans la veine antécubitale de témoins et de patients atteints de CCR dans des vacutainers en gel polymère activateur de caillot. Les Vacutainers d'échantillons complètement coagulés ont été centrifugés à 4 000 tr/min pendant 10 min à température ambiante (25 ◦C). Le sérum collecté a été aliquoté et conservé à -80 ◦C dans trois tubes Eppendorf exempts de DNase/RNase jusqu'à l'analyse.

4.3. Extraction de l'ARN total L'ARN total a été extrait des échantillons de sérum conformément aux directives de la procédure. L'ARN extrait a été dissous dans 40 µL d'eau exempte de RNase et stocké en aliquotes à -80 ◦C.

4.4. Quantification des ARN purifiés, y compris les miARN. La pureté et la concentration de l'ARN extrait sont évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre. La quantité d'ARN dans l'échantillon a été évaluée en utilisant l'absorbance à 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µL) et la pureté de l'ARN a été évaluée en utilisant des rapports d'absorbance à 260/280 nm.

4.5. Transcription inverse et mesure de l'expression des ARNnc à l'aide d'une réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative en temps réel (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Le kit premier brin en temps réel (RT2) a été utilisé pour la synthèse d'ADN complémentaire (ADNc) conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc obtenu a été stocké à -20 ◦C. Après transcription inverse, la qRT-PCR a été utilisée pour mesurer l'expression du lncRNA NNT-AS1 afin d'évaluer le niveau d'expression du lncRNA NNT-AS1, l'amorce RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. No. 330701) a été utilisé et les données ont été normalisées à l’aide du test RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. No. 330701) comme contrôle endogène. 4.5.2. La synthèse de l'ADNc hsa-miR-485-5p a été réalisée conformément aux directives de la procédure. L'ADNc obtenu a été stocké à -20 ◦C. Après transcription inverse, la qRT-PCR a été utilisée pour mesurer l'expression du hsa-miR-485-5p. Pour détecter le niveau d'expression de hsa-miR-485-5p, l'amorce hsa-hsa-miR-485-5p a été utilisée et les données ont été normalisées par le test PCR miARN (YP00203901, Cat. No. 339306) comme contrôle endogène. Le niveau d'expression de l'ARNnc en tant que changement de pli a été calculé et normalisé en utilisant l'approche du seuil de cycle (Ct) comme changement de pli (2- ΔΔCt) avec GAPDH ou SNORD38B (hsa) comme gènes de ménage pour lncRNA NNT-AS1 et hsa-miR-485. -5p, respectivement. ΔCt a été calculé en déduisant les valeurs Ct de GAPDH et SNORD38B (hsa) de celles des lncRNA NNT-AS1 et hsa-miR-485-5p étudiés, respectivement.

ΔΔCt = ΔCt échantillons de cancer - ΔCt échantillons de contrôle où (ΔCt=Ct cible - Ct référence) 4.5.3. Quantification de la protéine HSP90 par test immuno-enzymatique (ELISA) La HSP90 a été quantifiée par ELISA en utilisant le kit disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant. L'ELISA sandwich en phase solide humaine HSP90 alpha mesure la quantité de cible liée entre une paire d'anticorps correspondante. Dans les puits de la microplaque fournie, un anticorps spécifique à la cible a été pré-enduit. Dans ces puits, les échantillons, les standards ou les contrôles se lient à l’anticorps immobilisé (de capture). Le sandwich est construit en ajoutant le deuxième anticorps (détecteur), suivi de l'ajout d'une solution de substrat qui interagit avec la combinaison enzyme-anticorps-cible pour donner un signal quantifiable. La force de ce signal est proportionnelle à la concentration de la cible dans le matériau d'origine.

4.5.4. Mesure du CEA et du CA19-9 par dosage immunologique par électrochimiluminescence Les concentrations sériques de CA19-9 et de CEA ont été mesurées à l'aide d'un dosage immunologique par électrochimiluminescence utilisant Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Amérique du Nord.

4.5.4.1. Tests biochimiques de routine. Tests de la fonction hépatique : alanine aminotransférase (ALT), aspartate aminotransférase (AST) et albumine sérique. Les indicateurs de la fonction rénale, la créatinine sérique et l'urée, ont été déterminés pour tous les participants.

4.5.5. Ratios et indices Le calcul de l'indice de masse corporelle (IMC) en kg/m2 a été effectué pour tous les participants, où le poids normal = 18,5-24,9 kg/m2 , surpoids = 25-29,9 kg/m2 et obésité = IMC de 30 kg/m2 ou plus obésité morbide. Le rapport plaquettes/lymphocytes (PLR) est un indicateur lié à la réponse immunitaire et un biomarqueur systématique de l'inflammation, qui est supérieur au rapport neutrophiles/lymphocytes pour la corrélation avec la gravité de la maladie inflammatoire.