LncRNA Nikotiiniamidinukleotidi Transhydrogenaasi-Antisense RNA1 NNT-AS1 CRC:ssä

Kolorektaalisyöpä (CRC) on heterogeeninen pahanlaatuinen syöpä, joka vaikuttaa paksusuoleen ja peräsuoleen. Se on kolmanneksi yleisin ja tappavin pahanlaatuinen syöpä, noin 1,9 miljoonaa uutta tapausta ja lähes 9,4 prosenttia syöpään liittyvistä kuolemista vuonna 2020 maailmanlaajuisesti. CRC:n eloonjäämisaste riippuu enimmäkseen taudin vaiheesta diagnoosihetkellä. Siten CRC:n varhainen havaitseminen tarjoaa korkeamman viiden vuoden eloonjäämistodennäköisyyden, 80–90 %, verrattuna vain 14 prosenttiin myöhäisessä vaiheessa, jossa on etäpesäkkeitä. Kolonoskopia on kultainen standardi CRC-diagnoosin menetelmä. Suuren tarkkuutensa lisäksi se on invasiivinen tekniikka, johon liittyy huomattavia kuolleisuusriskejä, kuten suolen perforaatio ja verenvuoto, mikä rajoittaa sen käyttöä seulonnassa. Ulosteen piilevä veritesti, hiilihydraattiantigeeni 19-9 (CA19-9) ja karsinoembryoninen antigeeni (CEA) ovat tällä hetkellä saatavilla olevia CRC:n varhaisen diagnoosin seulonta-/kasvainmarkkeritestejä (TMs). Vaikka CEA- ja CA19-9-testit ovat yksinkertaisia, ei-invasiivisia, edullisia ja turvallisia, niiden diagnostinen tarkkuus on rajallinen. CRC:n seulonta ja varhainen diagnoosi on tunnistettu merkittävimmäksi kuolleisuutta alentavaksi tekijäksi. Pitkät ei-koodaavat RNA:t (lncRNA), jotka ovat yli 200 nukleotidin ei-koodaavia RNA:ita (ncRNA:ita), ovat joko yli-ilmentyneitä tai heikosti säädeltyjä lukuisissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, ja ne toimivat mahdollisina molekyylin välittäjinä eri kasvainten etenemiselle. Yli-ilmentyneet lncRNA:t toimivat onkogeeneinä, jotka lisäävät kasvainsolujen proliferaatiota, apoptoosia, invaasiota, etäpesäkkeitä ja autofagiaa. Useita lncRNA:ita on liitetty CRC:n esiintyvyyteen, etäpesäkkeisiin ja terapeuttiseen resistenssiin. Viimeaikaiset tutkimukset ehdottivat, että lncRNA Nikotiiniamidinukleotidi-transhydrogenaasi-antisense RNA1 (NNT-AS1), joka sijaitsee ihmisen 5p12-kromosomissa, osallistuu geenin ilmentymisen säätelyyn ja sillä on tärkeä rooli monissa syövissä, kuten rintasyövässä, kohdunkaulan syövässä. , hepatosellulaarinen karsinooma ja osteosarkooma, lncRNA NNT-AS1:n roolia CRC:ssä ei kuitenkaan tutkittu riittävästi. MikroRNA:t (miRNA:t) ovat pieniä ncRNA:ita, joiden pituus on ~22 nukleotidia ja jotka suorittavat erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, apoptoosin ja angiogeneesin. Kypsät miRNA-lajit, jotka tunnetaan myös nimellä miRNA-5p (ohjaussäie) ja -3p-lajit (matkustaja-miRNA), voivat olla peräisin sekä esiastedupleksin 5'- että 3'-haaroista. Ohjausjuoste on käsivarsi, joka on tarkoitettu ladattavaksi RNA-indusoituun vaimennuskompleksiin. Matkustajien miRNA:iden oletettiin tuhoutuneen kokonaan, mutta syvät sekvensointitutkimukset ovat paljastaneet, että tietyt pienet miRNA:t säilyttävät ja itse asiassa niillä on merkittävä rooli geenisäätelyssä. Lukuisat tutkimukset ovat löytäneet merkittävän yhteyden miR:n dysregulaation ja kasvaimen metastaasien välillä. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p sijaitsee ihmisen kromosomissa 14q32, ja se on tunnistettu syöpää estäväksi/kasvaimen suppressorigeeniksi useissa ihmisen pahanlaatuisissa kasvaimissa kohdistamalla ja säätelemällä alavirran soluproliferaatio- ja invaasiogeenien ilmentymistä. Hsa-miR-485-5p:n säätelytoiminto CRC:ssä on edelleen määrittelemätön. LncRNAs-miRs-vuorovaikutus kontrolloisi erilaisten syöpätyyppien ilmaantuvuutta ja/tai etenemistä, ja sitä pidettäisiin myös mahdollisena kohteena tulevalle hoitokeksinnölle. LncRNA NNT-AS1:n havaittiin edistävän kolangiokarsinooman proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota hsa-miR-485:n kautta. Tämä prosessi nosti β-kateniinia ja B-solujen kroonista lymfaattista leukemiaa (CLL)/lymfoomaa 9 (BCL9) vasteena. LncRNA NNT-AS1:n suhde hsa-miR-485-5p:hen CRC:ssä on vielä määritettävä kliinisesti. Useimmissa soluissa ei-stressi-asetuksissa lämpöshokkiproteiini 90 (HSP90) ovat erittäin konservoituneita molekyylikaperoneja, jotka muodostavat 1-2 % kaikista solun proteiineista. HSP90-proteiinien tärkeitä toimintoja ovat proteiinin laskostuminen ja hajoaminen. Fysiologisesti molekyylikaperoni HSP90AB1 -vuorovaikutuksella muiden kochaperonien kanssa on ratkaiseva osa vastasyntyneiden proteiinien laskostumisessa tai denaturoituneiden proteiinien stabiloinnissa ja uudelleenlaskostuksessa stressin jälkeen, mutta patologisesti se osallistuu kasvainten muodostumiseen. Esimerkiksi osteosarkoomassa hsa-miR-485-5p sitoutuu 3'

- HSP90:n lähetti-RNA:n (mRNA) transloimaton alue (UTR) HSP90-proteiinin tuotannon vähentämiseksi, mikä siten aiheuttaa kasvainta suppressoivan vaikutuksen. Siksi tutkimus on perusteltua määrittää lncRNA:n NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-akselin kliininen merkitys CRC-potilailla.

Nykyisessä tutkimuksessa verrataan lncRNA NNT-AS1:n ja hsa-miR-485-5p:n sekä HSP90-seerumitasoja sekä terveiden että CRC-potilaiden kohortin perifeerisissä verinäytteissä. Toiseksi, tutki, käytettäisiinkö lncRNA:n NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90-akselia tai erikseen tutkittua ei-invasiivista molekyylitarkkuusbiomarkkeria nestebiopsiassa paremman diagnostisen hyödyn saamiseksi CRC-potilaille. Perustuu myös CRC-potilaiden ryhmittelyyn histologisten asteiden 1-3 mukaan. Lopuksi, tutki todennäköistä yhteyttä/korrelaatiota lncRNA:n NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90:n välillä akselina tai yksittäin CRC:n egyptiläisten potilaiden kohortissa suhteessa demografisiin tietoihin tai kliinisiin patologisiin ominaisuuksiin. Kaikki löydökset vahvistetaan tai suljetaan pois myös in silico -menetelmillä.

3.1. Potilasryhmä Tutkimukseen otettiin yhteensä 60 CRC-potilasta. CRC-potilaat olivat aiemmin hoitamattomia egyptiläisten potilaiden kohorttia, jotka otettiin Clinical Oncology Cliniciin, National Cancer Institute (NCI), Kairon yliopisto, Kairo, Egypti. Mies-nainen 1:1 (30/30) ja heidän ikähaitarinsa 24-76 vuotta.

3.2. Kontrolliryhmä 28 ikään ja sukupuoleen sopivaa näennäisesti tervettä vapaaehtoista, jotka valittiin satunnaisesti normaalin tarkastustutkimuksen tai verenluovutuksen aikana otetuista koehenkilöistä. Kontrolliryhmän osallistujat eivät käyttäneet mitään lääkkeitä tai kärsineet mistään sairaudesta. Kontrolli-ikähaarukka on 40-60 vuotta ja 13:15 miehistä naisiin. Potilasryhmälle (n = 60) kirjattiin täydellinen historia. Jos potilas täytti osallistumiskriteerit ja annettuaan suostumuksensa tutkimukseen osallistumiselle ja allekirjoitettuaan tietoisen suostumuksen, perifeeriset verinäytteet otettiin diagnoosihetkellä. Jos potilas täytti poissulkemiskriteerit, verinäytteitä ei otettu. Potilaiden mukaanottokriteerit olivat ne, jotka kävivät kolonoskopiayksikössä paksusuolen tutkimuksessa ja joilla oli erilaisia ​​paksusuolen oireita, mukaan lukien CRC-oireet, ummetus, vatsakipu, peräsuolen verenvuoto ja äkillinen painonpudotus. CRC-diagnoosi vahvistettiin kliinisesti kolonoskopialla, vatsan röntgenkuvauksella ja histopatologisella tutkimuksella. Potilaiden poissulkemiskriteerit sisälsivät kemoterapiaa, sädehoitoa tai leikkausta saaneet henkilöt, potilaat, joilla oli verisairauksia tai mikä tahansa muu syöpä kuin CRC. Tutkimuksesta suljettiin pois henkilöt, joilla oli riittämättömät tiedot tai puuttuvat histopatologiset diagnoosit, sekä ne, joilla oli etäpesäkkeitä.

3.2.1. Potilaiden patologiset ja kliiniset tiedot CRC-potilaiden kasvaimen kliininen arviointi tehtiin patologiayksikössä, NCI, Kairo, Kairon yliopisto. Potilaan kolorektaalileikkaushistorian lisäksi kaikkien CRC:hen osallistuneiden syöpätautien täydellinen sukuhistoria kirjattiin. NCI:ssä CRC-vaihe määritettiin kolonoskopiatulosten, vatsan röntgenkuvauksen, patologisten analyysien ja kliinisten päätösten perusteella perustuen näihin tuloksiin ja American Joint Committee on Cancer (AJCC) kriteereihin vuonna 2010. Potilaat luokitellaan kolmeen vaiheeseen; vaihe I/II: paikallinen syöpä, vaihe III: imusolmukkeiden (LN) paikallinen osallistuminen (N1-x) ja vaihe IV: kaukainen etäpesäke (M1). Potilastiedostoista havaittiin LN:n osallistuminen laajentumisen ilmaantuvuuden ollessa joko ei (N0) tai läsnä (N1). CRC-potilaiden sukuhistoria, tupakointitila, ei-tarttuvien tautien tila kuten diabetes mellitus (DM) ja verenpainetauti (HTN) kirjattiin. Kasvainkohta, kasvaimen koko, limakalvomainen vai ei, imusolmukkeiden etäpesäke (LNM), kasvaimen invaasio tai verisuoniinvaasio, kasvaimen erilaistuminen, kasvaimen aste, kasvain-solmumetastaasin (TNM) vaihe, tulehdustila tulehdukselliseksi suolistosairaudeksi (IBD), CRC NCI:n biokemiallisen analyysin yksikkö tai tilastoyksikkö arvioivat potilastiedostoista kerätyn koolonin tai peräsuolen sijainnin sekä poikittais-, sigmoid-, rektosigmoid- ja peräsuolen CRC-oireet. Hemoglobiini (Hgb), protrombiiniaika (PT), erytrosyyttien sedimentaationopeus (ESR), verihiutaleiden määrä, lymfosyyttien määrä, laktaattidehydrogenaasi (LDH), C-reaktiivinen proteiini (CRP), kaikki kirjattiin Kairon NCI:ssä tehdyistä potilastiedostoista. Egypti, Central Clinical Biochemistry Lab. 4.2. Verinäytteet Viisi millilitraa perifeeristä laskimoveren nestebiopsiaa otettiin kyynärpäälaskimosta kontrolleilta ja CRC-potilailta hyytymisaktivaattoripolymeerigeelivacutainereihin. Täysin koaguloituneiden näytteiden vacutainers sentrifugoitiin nopeudella 4000 rpm 10 minuuttia huoneenlämpötilassa (25 °C). Kerätty seerumi jaettiin eriin ja pidettiin -80 °C:ssa kolmessa DNaasi/RNaasivapaassa Eppendorf-putkessa analyysiin asti.

4.3. RNA:n kokonaisuutto Kokonais-RNA uutettiin seeruminäytteistä menettelyohjeiden mukaisesti. Uutettu RNA liuotettiin 40 ul:aan RNaasivapaata vettä ja säilytettiin erissä -80 °C:ssa.

4.4 Puhdistetun RNA:n, mukaan lukien miRNA:t, kvantifiointi Uutetun RNA:n puhtaus ja pitoisuus arvioidaan käyttämällä spektrofotometriä. RNA:n määrä näytteessä arvioitiin käyttämällä absorbanssia aallonpituudella 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/µl), ja RNA:n puhtaus arvioitiin käyttämällä absorbanssia 260/280 nm:ssä.

4.5. ncRNA:iden käänteistranskription ja ilmentymisen mittaus kvantitatiivisella reaaliaikaisella käänteistranskription polymeraasiketjureaktiolla (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Reaaliaikaista (RT2) First Strand Kitiä käytettiin komplementaariseen DNA:n (cDNA) synteesiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Saatu cDNA säilytettiin -20 °C:ssa. Käänteistranskription jälkeen qRT-PCR:ää käytettiin mittaamaan lncRNA NNT-AS1:n ilmentymistä lncRNA NNT-AS1:n ilmentymistason arvioimiseksi, alukkeen RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. No. 330701) käytettiin, ja tiedot normalisoitiin käyttämällä RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH (LPH31725A-200, Cat. nro 330701) endogeenisenä kontrollina. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA-synteesi suoritettiin menettelyohjeiden mukaisesti. Saatu cDNA säilytettiin -20 °C:ssa. Käänteistranskription jälkeen qRT-PCR:ää käytettiin mittaamaan hsa-miR-485-5p:n ilmentyminen. hsa-miR-485-5p:n ekspressiotason havaitsemiseksi käytettiin aluketta hsa-hsa-miR-485-5p ja tiedot normalisoitiin miRNA PCR Assay (YP00203901, Cat. nro 339306) endogeenisenä kontrollina. ncRNA:n ilmentymistaso kertamuutoksena laskettiin ja normalisoitiin käyttämällä syklin kynnys (Ct) lähestymistapaa kertaiseksi muutoksena (2-ΔΔCt) GAPDH:n tai SNORD38B:n (hsa) kanssa lncRNA:n NNT-AS1:n ja hsa-miR-485:n taloudenhoitogeeneinä. -5p vastaavasti. ΔCt laskettiin vähentämällä GAPDH:n ja SNORD38B:n (hsa) Ct-arvot tutkittavana olevan lncRNA NNT-AS1:n ja hsa-miR-485-5p:n Ct-arvoista vastaavasti.

ΔΔCt = ΔCt syöpänäytteet - ΔCt kontrollinäytteet jossa (ΔCt = Ct kohde - Ct viite) 4.5.3. HSP90-proteiinin kvantifiointi entsyymi-immunosorbenttimäärityksellä (ELISA) HSP90 kvantifioitiin ELISA:lla käyttämällä kaupallisesti saatavaa pakkausta valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ihmisen HSP90 alfa-kiinteän faasin sandwich-ELISA mittaa yhteensopivan vasta-aineparin välille sitoutuneen kohteen määrää. Mukana toimitetun mikrolevyn kuoppiin on esipäällystetty kohdespesifinen vasta-aine. Näissä kuopissa näytteet, standardit tai kontrollit sitoutuvat immobilisoituun (sieppaus)vasta-aineeseen. Sandwich rakennetaan lisäämällä toinen (detektori) vasta-aine, minkä jälkeen lisätään substraattiliuos, joka on vuorovaikutuksessa entsyymi-vasta-aine-kohde-yhdistelmän kanssa antamaan kvantitatiivisen signaalin. Tämän signaalin voimakkuus on verrannollinen kohteen pitoisuuteen alkuperäisessä materiaalissa.

4.5.4. CEA:n ja CA19-9:n mittaus elektrokemiluminesenssi-immunomäärityksellä Seerumin CA19-9- ja CEA-pitoisuudet mitattiin käyttämällä elektrokemiluminesenssi-immunomääritystä käyttäen Cobas® e 602:ta, RocheDiagnostics, Pohjois-Amerikka.

4.5.4.1. Rutiininomaiset biokemialliset testit. Maksan toimintakokeet: alaniiniaminotransferaasi (ALT), aspartaattiaminotransferaasi (AST) ja seerumin albumiini. Munuaisten toiminta-indikaattorit seerumin kreatiniini ja urea määritettiin kaikille osallistujille.

4.5.5. Suhteet ja indeksit Painoindeksin (BMI) laskeminen kg/m2 tehtiin kaikille osallistujille, joissa normaalipaino = 18,5-24,9 kg/m2, ylipaino = 25-29,9 kg/m2 ja liikalihavuus = BMI 30 kg/m2 tai suurempi sairaalloinen liikalihavuus. Verihiutale-lymfosyyttisuhde (PLR) on immuunivasteeseen liittyvä indikaattori ja systemaattinen tulehduksen biomarkkeri, joka on parempi kuin neutrofiilien ja lymfosyyttien välinen suhde tulehdussairauden vaikeusasteen suhteen.