LncRNA Nicotinamida Nucleótido Transhidrogenasa-ARN1 antisentido NNT-AS1 en CCR

El cáncer colorrectal (CCR) es una neoplasia maligna heterogénea que afecta al colon y al recto. Es la tercera neoplasia maligna más prevalente y letal, con aproximadamente 1,9 millones de casos nuevos y casi el 9,4% de las muertes relacionadas con el cáncer en 2020 en todo el mundo. La tasa de supervivencia del CCR depende principalmente del estadio de la enfermedad en el momento del diagnóstico. Por lo tanto, la detección temprana del CCR proporciona una mayor probabilidad de supervivencia a 5 años del 80-90%, en comparación con sólo el 14% en la etapa tardía con metástasis a distancia. La colonoscopia es el método de referencia para el diagnóstico del CCR. Además de su gran precisión, se trata de una técnica invasiva con considerables riesgos de mortalidad, como perforación y hemorragia intestinal, lo que limita su uso para el cribado. La prueba de sangre oculta en heces, el antígeno carbohidrato 19-9 (CA19-9) y el antígeno carcinoembrionario (CEA) son las pruebas de diagnóstico temprano de CCR/marcadores tumorales (TM) disponibles actualmente. Aunque las pruebas CEA y CA19-9 son sencillas, no invasivas, asequibles y seguras, su precisión diagnóstica es limitada. Se ha identificado que la detección y el diagnóstico precoz del CCR son el factor más importante para reducir la mortalidad. Los ARN no codificantes largos (lncRNA), que son ARN no codificantes (ncRNA) de más de 200 nucleótidos, están sobreexpresados ​​o regulados negativamente en numerosas neoplasias malignas y actúan como mediadores moleculares potenciales para la progresión de varios tumores. Los lncRNA sobreexpresados ​​actúan como oncogenes que mejoran la proliferación de células tumorales, la apoptosis, la invasión, la metástasis y la autofagia. Varios lncRNA se han relacionado con la incidencia, metástasis y resistencia terapéutica del CCR. Investigaciones recientes sugirieron que el ARN1 antisentido transhidrogenasa nucleótido de nicotinamida (NNT-AS1), que se localiza en el cromosoma humano 5p12, participa en la regulación de la expresión genética y desempeña funciones importantes en una variedad de cánceres, como el cáncer de mama y el cáncer de cuello uterino. , carcinoma hepatocelular y osteosarcoma; sin embargo, no se realizó suficiente investigación sobre el papel del lncRNA NNT-AS1 en el CCR. Los microARN (miARN) son pequeños ncARN con una longitud de ~22 nucleótidos, que realizan una variedad de funciones biológicas como la proliferación celular, la apoptosis y la angiogénesis. Las especies de miARN maduro, también conocidas como miARN-5p (cadena guía) y especies -3p (miARN pasajero), pueden originarse en los brazos 5' y 3' del dúplex precursor. El brazo destinado a cargarse en el complejo silenciador inducido por ARN es la cadena guía. Se suponía que los miARN pasajeros estaban completamente destruidos; sin embargo, investigaciones de secuenciación profundas han revelado que ciertos miARN menores retienen y, de hecho, desempeñan un papel significativo en la regulación genética. Numerosos estudios han encontrado una asociación sustancial entre la desregulación de los miR y la metástasis tumoral. Homo sapiens (hsa)-miR-485-5p se encuentra en el cromosoma humano 14q32 y se ha identificado como un gen anticancerígeno/supresor de tumores en varias neoplasias malignas humanas, al apuntar y regular la expresión de genes de invasión y proliferación celular posteriores. La función reguladora de hsa-miR-485-5p en el CCR aún está indeterminada. La interacción LncRNAs-miRs controlaría la incidencia y/o progresión de varios tipos de cáncer, además de ser considerada como un objetivo potencial para futuras invenciones de tratamientos. Se descubrió que el lncRNA NNT-AS1 promueve la proliferación, migración e invasión del colangiocarcinoma mediante la esponja hsa-miR-485. Este proceso de esponjamiento elevó la β-catenina y la leucemia linfocítica crónica (CLL)/linfoma 9 (BCL9) de células B en respuesta. La relación de LncRNA NNT-AS1 con hsa-miR-485-5p en CCR aún no se ha determinado clínicamente. En la mayoría de las células, en entornos sin estrés, la proteína de choque térmico 90 (HSP90) son chaperonas moleculares altamente conservadas que constituyen entre el 1 y el 2% de todas las proteínas celulares. Las funciones importantes de las proteínas HSP90 incluyen el plegamiento y la degradación de proteínas. Fisiológicamente, las interacciones de la chaperona molecular HSP90AB1 con otras cochaperonas desempeñan un papel crucial en el plegamiento de las proteínas recién generadas o en la estabilización y replegamiento de proteínas desnaturalizadas después del estrés, pero, patológicamente, está involucrada en la tumorigénesis. Por ejemplo, dentro del osteosarcoma, hsa-miR-485-5p se une al 3'

-región no traducida (UTR) del ARN mensajero (ARNm) de HSP90 para reducir la producción de proteína HSP90, ejerciendo así un efecto supresor de tumores. Por lo tanto, se justifica la investigación para determinar la importancia clínica del eje lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 en pacientes con CCR.

El estudio actual comparará el nivel de expresión en sangre de lncRNA NNT-AS1 y hsa-miR-485-5p, así como los niveles séricos de HSP90 en muestras de sangre periférica de cohorte de pacientes egipcios con CCR tanto sanos como. En segundo lugar, examinar si el eje lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90, o investigado individualmente, se utilizaría como biomarcador de precisión molecular no invasivo en biopsia líquida para una mejor utilidad diagnóstica para pacientes con CCR. Además, según la estratificación del grupo de pacientes con CCR por grados histológicos 1-3. Finalmente, investigue el probable vínculo/correlación entre el lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 como eje o individualmente en la cohorte de pacientes egipcios con CCR en relación con datos demográficos o características clínico-patológicas. Todos los hallazgos también serán confirmados o descartados por medios in silico.

3.1. Grupo de pacientes Se inscribieron en el estudio un total de 60 pacientes con CCR. Los pacientes con CCR eran una cohorte de pacientes egipcios sin tratamiento previo admitidos en la Clínica de Oncología Clínica del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de la Universidad de El Cairo, El Cairo, Egipto. Hombre a mujer 1:1 (30/30) y su rango de edad 24-76 años.

3.2. Grupo de control: 28 voluntarios aparentemente sanos de la misma edad y sexo, seleccionados al azar entre los sujetos incluidos durante un examen de control normal o durante la donación de sangre. Los participantes del grupo de control no tomaban ningún medicamento ni padecían ninguna enfermedad. El rango de edad de los controles es de 40 a 60 años y 13:15 de hombre a mujer. Para el grupo de pacientes (n = 60) se registró una historia completa. Si un paciente cumplía con los criterios de inclusión y, luego de dar su aprobación para participar en el estudio y firmar el consentimiento informado, se le tomaban muestras de sangre periférica al momento del diagnóstico. Si un paciente cumplía los criterios de exclusión, no se tomaban muestras de sangre. Los criterios de inclusión de pacientes fueron aquellos que visitaron la Unidad de Colonoscopia para un examen colorrectal y tenían una variedad de síntomas colónicos, incluidos síntomas notables de CCR, estreñimiento, dolor abdominal, sangrado rectal y pérdida repentina de peso. El diagnóstico de CCR se confirmó clínicamente mediante colonoscopia, radiografía abdominal y examen histopatológico. Los criterios de exclusión de pacientes incluyeron personas que recibieron quimioterapia, radiación o se sometieron a cirugía, pacientes con trastornos sanguíneos o cualquier cáncer distinto del CCR. Se excluyeron del estudio las personas con datos inadecuados o diagnósticos histopatológicos faltantes, así como aquellos con metástasis a distancia.

3.2.1. Datos patológicos y clínicos de los pacientes La evaluación clínica del tumor de los pacientes con CCR se realizó en la Unidad de Patología del NCI, El Cairo, Universidad de El Cairo. Además de los antecedentes de cirugía colorrectal del paciente, se registró el historial familiar completo de enfermedad cancerosa de todos los participantes del CRC. En el NCI, la estadificación del CCR se determinó mediante los resultados de la colonoscopia, la radiografía abdominal, los análisis patológicos y las decisiones clínicas, basándose en estos resultados y en los criterios del American Joint Committee on Cancer (AJCC) de 2010. Los pacientes se clasifican en tres etapas; estadio I/II: cáncer local, estadio III: afectación localizada de ganglios linfáticos (LN) (N1-x) y estadio IV: metástasis a distancia (M1). En los archivos de los pacientes se registró afectación del LN con incidencia de agrandamiento como no (N0) o presente (N1). Se registraron los antecedentes familiares de los pacientes con CCR, el tabaquismo y las enfermedades no transmisibles como diabetes mellitus (DM) e hipertensión (HTA). Sitio del tumor, tamaño del tumor, mucinoso o no, metástasis a ganglios linfáticos (LNM), invasión tumoral o invasión vascular, diferenciación tumoral, grado del tumor, estadificación de metástasis a ganglios tumorales (TNM), estado de inflamación como enfermedad inflamatoria intestinal (EII), CCR La ubicación de los síntomas clínicos del CCR, si son colónicos o rectales, así como si son transversales, sigmoideos, rectosigmoideos y rectales, fueron evaluados por la Unidad de Análisis Bioquímico del NCI o la Unidad de Estadísticas, recopilados de los archivos de los pacientes. La hemoglobina (Hgb), el tiempo de protrombina (PT), la velocidad de sedimentación globular (ESR), el recuento de plaquetas, el recuento de linfocitos, la lactato deshidrogenasa (LDH) y la proteína C reactiva (PCR), se registraron en los archivos de los pacientes realizados en el NCI de El Cairo. Egipto, Laboratorio Central de Bioquímica Clínica. 4.2. Muestras de sangre Se recogieron cinco mililitros de biopsia líquida de sangre venosa periférica de la vena antecubital de controles y pacientes con CCR en vacutainers de gel de polímero activador de coágulos. Se centrifugaron vacutainers de muestras completamente coaguladas a 4000 r.p.m durante 10 min a temperatura ambiente (25 ◦C). El suero recolectado se distribuyó en alícuotas y se mantuvo a -80 ◦C en tres tubos Eppendorf libres de DNasa/RNasa hasta el análisis.

4.3. Extracción de ARN total El ARN total se extrajo de muestras de suero de acuerdo con las directrices del procedimiento. El ARN extraído se disolvió en 40 µL de agua libre de RNasa y se almacenó en alícuotas a -80 ◦C.

4.4. Cuantificación de ARN purificado, incluidos los miARN. La pureza y concentración del ARN extraído se evalúan mediante un espectrofotómetro. La cantidad de ARN en la muestra se evaluó mediante absorbancia a 260 nm (A260 = 1 → 44 ng/μL) y la pureza del ARN se evaluó mediante absorbancia en proporciones de 260/280 nm.

4.5. Transcripción inversa y medición de expresión de ncRNA mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 Se utilizó el kit First Strand en tiempo real (RT2) para la síntesis de ADN complementario (ADNc) según las instrucciones del fabricante. El ADNc obtenido se almacenó a -20 ◦C. Después de la transcripción inversa, se utilizó qRT-PCR para medir la expresión del lncRNA NNT-AS1 para evaluar el nivel de expresión del lncRNA NNT-AS1, el cebador RT2 lncRNA qPCR Assay for Human NNT-AS1 (LPH15988A-200, Cat. No. 330701) y los datos se normalizaron utilizando el ensayo RT2 lncRNA qPCR para GAPDH humano (LPH31725A-200, cat. No. 330701) como control endógeno. 4.5.2. La síntesis de ADNc de hsa-miR-485-5p se realizó según las instrucciones de las pautas del procedimiento. El ADNc obtenido se almacenó a -20 ◦C. Después de la transcripción inversa, se utilizó qRT-PCR para medir la expresión de hsa-miR-485-5p. Para detectar el nivel de expresión de hsa-miR-485-5p, se utilizó el cebador hsa-hsa-miR-485-5p y los datos se normalizaron con el ensayo de PCR de miARN (YP00203901, Cat. No. 339306) como control endógeno. El nivel de expresión de ncRNA como cambio de veces se calculó y normalizó utilizando el enfoque del umbral del ciclo (Ct) como cambio de veces (2- ΔΔCt) con GAPDH o SNORD38B (hsa) como genes de mantenimiento para el lncRNA NNT-AS1 y hsa-miR-485. -5p, respectivamente. ΔCt se calculó deduciendo los valores de Ct de GAPDH y SNORD38B (hsa) de los del lncRNA NNT-AS1 y hsa-miR-485-5p en estudio, respectivamente.

ΔΔCt = ΔCt muestras de cáncer - ΔCt muestras de control donde (ΔCt=Ct objetivo - Ct de referencia) 4.5.3. Cuantificación de la proteína HSP90 mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) La HSP90 se cuantificó mediante ELISA utilizando el kit disponible comercialmente según las instrucciones del fabricante. El ELISA sándwich de fase sólida HSP90 alfa humana mide la cantidad de diana unida entre un par de anticuerpos coincidentes. En los pocillos de la microplaca suministrada se ha recubierto previamente un anticuerpo específico del objetivo. En estos pocillos, las muestras, estándares o controles se unen al anticuerpo inmovilizado (de captura). El sándwich se construye añadiendo el segundo anticuerpo (detector), seguido de la adición de una solución de sustrato que interactúa con la combinación enzima-anticuerpo-objetivo para dar una señal cuantificable. La fuerza de esta señal es proporcional a la concentración del objetivo en el material original.

4.5.4. Medición de CEA y CA19-9 mediante inmunoensayo de electroquimioluminiscencia Las concentraciones séricas de CA19-9 y CEA se midieron mediante un inmunoensayo de electroquimioluminiscencia utilizando Cobas® e 602, RocheDiagnostics, Norteamérica.

4.5.4.1. Pruebas bioquímicas de rutina. Pruebas de función hepática: alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y albúmina sérica. Se determinaron los indicadores de función renal, creatinina sérica y urea en todos los participantes.

4.5.5. Ratios e índices Se realizó el cálculo del índice de masa corporal (IMC) en kg/m2 para todos los participantes, donde el peso normal = 18,5-24,9 kg/m2, sobrepeso = 25-29,9 kg/m2, y obesidad = IMC de 30 kg/m2 o mayor obesidad mórbida. La relación plaquetas-linfocitos (PLR) es un indicador relacionado con la respuesta inmune y un biomarcador de inflamación sistemática, que es superior a la relación neutrófilos-linfocitos en cuanto a correlación con la gravedad de la enfermedad inflamatoria.