CRC의 LncRNA 니코틴아미드 뉴클레오티드 트랜스하이드로게나제-안티센스 RNA1 NNT-AS1

대장암(CRC)은 결장과 직장에 영향을 미치는 이종 악성 종양입니다. 이는 세 번째로 가장 흔하고 치명적인 악성 종양으로, 2020년 전 세계적으로 약 190만 건의 새로운 사례가 발생하고 암 관련 사망의 거의 9.4%가 발생합니다. CRC 생존율은 대부분 진단 당시 질병의 단계에 따라 달라집니다. 따라서 CRC의 조기 발견은 원격 전이가 있는 후기 단계의 14%에 비해 80-90%의 더 높은 5년 생존 확률을 제공합니다. 대장내시경검사는 CRC 진단을 위한 최적의 표준 방법입니다. 높은 정확도와 함께 장 천공 및 출혈과 같은 상당한 사망 위험이 있는 침습적 기술이므로 선별 검사에 사용이 제한됩니다. 대변잠혈검사, 탄수화물 항원 19-9(CA19-9) 및 암배아항원(CEA)은 현재 이용 가능한 대장암 조기 진단 선별검사/종양 표지자(TM) 검사입니다. CEA 및 CA19-9 테스트는 간단하고 비침습적이며 저렴하고 안전하지만 진단 정확도는 제한적입니다. CRC에 대한 선별검사와 조기 진단은 사망률을 낮추는 가장 중요한 요인으로 확인되었습니다. 200개 이상의 뉴클레오티드 비코딩 RNA(ncRNA)인 긴 비코딩 RNA(lncRNA)는 수많은 악성 종양에서 과발현되거나 하향 조절되며 다양한 종양 진행에 대한 잠재적인 분자 매개체 역할을 합니다. 과발현된 lncRNA는 종양 세포 증식, 세포사멸, 침입, 전이 및 자가포식을 강화하는 종양 유전자 역할을 합니다. 몇몇 lncRNA는 CRC의 발생률, 전이 및 치료 저항성과 연관되어 있습니다. 최근 연구에 따르면 인간 염색체 5p12에 위치하는 lncRNA Nicotinamide Nucleotide Transhydrogenase-antisense RNA1(NNT-AS1)은 유전자 발현 조절에 관여하고 유방암, 자궁경부암 등 다양한 암에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 그러나 간세포암종, 골육종 등에서는 CRC에서의 lncRNA NNT-AS1 역할에 대한 연구가 부족했다. MicroRNA(miRNA)는 ~22개 뉴클레오티드 길이의 작은 ncRNA로, 세포 증식, 세포사멸 및 혈관 신생과 같은 다양한 생물학적 기능을 수행합니다. miRNA-5p(가이드 가닥) 및 -3p 종(패신저 miRNA)으로도 알려진 성숙한 miRNA 종은 전구체 이중체의 5' 및 3' 팔 모두에서 유래할 수 있습니다. RNA 유도 침묵 복합체에 로드될 예정인 팔은 가이드 가닥입니다. Passenger miRNA는 완전히 파괴된 것으로 추정되었지만, 심층적인 시퀀싱 조사를 통해 특정 소수의 miRNA가 유지되고 실제로 유전자 조절에 의미 있는 역할을 한다는 사실이 밝혀졌습니다. 수많은 연구에서 miRs 조절 장애와 종양 전이 사이의 실질적인 연관성이 발견되었습니다. 호모 사피엔스(hsa)-miR-485-5p는 인간 염색체 14q32에 위치하며 하류 세포 증식 및 침입 유전자의 발현을 표적화하고 조절함으로써 여러 인간 악성 종양에서 항암/종양 억제 유전자로 확인되었습니다. CRC에서 hsa-miR-485-5p의 규제 기능은 아직 결정되지 않았습니다. LncRNAs-miRs 상호작용은 다양한 암 유형의 발생 및/또는 진행을 제어할 뿐만 아니라 향후 치료법 발명의 잠재적인 표적으로 간주됩니다. LncRNA NNT-AS1은 스펀지 hsa-miR-485를 통해 담관암종의 증식, 이동 및 침습을 촉진하는 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 스펀지 처리 과정은 이에 반응하여 β-카테닌과 B세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/림프종 9(BCL9)을 증가시켰습니다. CRC의 hsa-miR-485-5p와 LncRNA NNT-AS1의 관계는 임상적으로 아직 결정되지 않았습니다. 대부분의 세포에서 스트레스가 없는 환경에서 열 충격 단백질 90(HSP90)은 모든 세포 단백질의 1~2%를 구성하는 고도로 보존된 분자 샤페론입니다. HSP90 단백질의 중요한 기능에는 단백질 접힘 및 분해가 포함됩니다. 생리학적으로, 분자 샤페론 HSP90AB1과 다른 공동 샤페론의 상호작용은 새로 생성된 단백질의 접힘 또는 스트레스 후 변성된 단백질의 안정화 및 재접힘에 중요한 역할을 하지만, 병리학적으로는 종양 형성에 관여합니다. 예를 들어, 골육종 내에서 hsa-miR-485-5p는 3'에 결합합니다.

-HSP90 메신저 RNA(mRNA)의 번역되지 않은 영역(UTR)은 HSP90 단백질 생산을 감소시켜 종양 억제 효과를 발휘합니다. 따라서 CRC 환자에서 lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 축의 임상적 중요성을 결정하기 위한 연구가 필요합니다.

현재 연구에서는 건강한 환자와 CRC 이집트 환자의 코호트 말초 혈액 샘플 모두에서 lncRNA NNT-AS1 및 hsa-miR-485-5p의 혈액 발현 수준과 HSP90 혈청 수준을 비교할 것입니다. 둘째, lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90 축이 CRC 환자에 대한 더 나은 진단 유틸리티를 위해 액체 생검에서 비침습적 분자 정밀 바이오마커로 사용되는지 또는 개별적으로 조사되는지 조사합니다. 또한 조직학적 등급 1~3에 따른 CRC 환자의 그룹 계층화를 기반으로 합니다. 마지막으로, 인구통계학적 데이터 또는 임상병리학적 특성과 관련하여 CRC 이집트 환자 집단에서 lncRNA NNT-AS1/hsa-miR-485-5p/HSP90을 축으로 또는 개별적으로 사이의 가능한 연결/상관관계를 조사합니다. 모든 결과는 인실리코 방식으로도 확인되거나 배제됩니다.

3.1. 환자군 총 60명의 CRC 환자가 연구에 등록되었습니다. CRC 환자는 이집트 카이로 소재 카이로 대학교 국립 암 연구소(NCI)의 임상 종양학 클리닉에 입원한 치료 경험이 없는 이집트 환자 코호트였습니다. 남성 대 여성 1:1(30/30)이며 연령 범위는 24~76세입니다.

3.2. 대조군 28명의 연령과 성별이 일치하는 겉으로 보기에 건강한 지원자로서 일반 검진 검사 또는 헌혈 중에 모집된 피험자 중에서 무작위로 선택되었습니다. 대조군 참가자들은 어떤 약도 복용하지 않았으며 어떤 질병도 앓고 있지 않았습니다. 통제 연령 범위는 40~60세이며 남성 대 여성의 비율은 13:15입니다. 환자 그룹(n = 60)의 경우 전체 병력이 기록되었습니다. 환자가 포함 기준을 충족하고 연구 참여를 승인하고 사전 동의서에 서명한 후 진단 당시 말초 혈액 샘플을 채취했습니다. 환자가 제외 기준을 충족하는 경우 혈액 샘플을 채취하지 않았습니다. 환자 포함 기준은 대장직장 검사를 위해 대장내시경실을 방문하여 대장암으로 인한 눈에 띄는 증상, 변비, 복통, 직장 출혈, 급격한 체중 감소 등 다양한 대장 증상을 보이는 자로 하였다. CRC 진단은 대장내시경, 복부 방사선 영상, 조직병리학적 검사를 통해 임상적으로 확인되었습니다. 환자 제외 기준에는 화학 요법, 방사선 치료를 받거나 수술을 받은 개인, 혈액 질환 또는 CRC 이외의 암 환자가 포함되었습니다. 데이터가 불충분하거나 조직병리학적 진단이 누락된 개인, 원격 전이가 있는 개인은 연구에서 제외되었습니다.

3.2.1. 환자 병리학적 및 임상 데이터 CRC 환자 종양의 임상적 평가는 카이로 대학교 카이로 NCI 병리학부에서 수행되었습니다. 환자의 대장 수술 병력 외에도 모든 CRC 참가자에 대해 암 질환의 전체 가족력이 기록되었습니다. 국립암연구소에서는 대장내시경 결과, 복부 방사선 촬영, 병리학적 분석 및 임상적 결정에 따라 CRC 병기 결정을 결정했으며, 이러한 결과와 미국 암 합동위원회(AJCC) 기준 2010을 바탕으로 했습니다. 환자는 세 단계로 분류됩니다. I/II기: 국소 암, III기: 림프절(LN) 국소 침범(N1-x), IV기: 원격 전이(M1). 확대 발생률이 없는(N0) 또는 존재하는(N1) LN 침범이 환자 파일에서 기록되었습니다. CRC 환자의 가족력, 흡연 상태, 당뇨병(DM) 및 고혈압(HTN)과 같은 비전염성 질환 상태를 기록했습니다. 종양 부위, 종양 크기, 점액성 여부, 림프절 전이(LNM), 종양 침윤 또는 혈관 침범, 종양 분화, 종양 등급, 종양-절 전이(TNM) 병기, 염증성 장 질환(IBD)으로서의 염증 상태, CRC 결장 또는 직장의 경우 위치, 가로형, S자형, 직장 S상형 및 직장인 경우 CRC 임상 증상은 환자 파일에서 수집된 NCI 생화학 분석 장치 또는 통계 장치에 의해 평가되었습니다. 헤모글로빈(Hgb), 프로트롬빈 시간(PT), 적혈구 침강 속도(ESR), 혈소판 수, 림프구 수, 젖산염 탈수소효소(LDH), C 반응성 단백질(CRP)은 모두 카이로 NCI에서 수행된 환자 파일에서 기록되었습니다. 이집트 중앙임상생화학연구실 4.2. 혈액 샘플 5밀리리터의 말초 정맥 혈액 액체 생검을 대조군과 CRC 환자의 전주정맥에서 응고 활성화제 폴리머 겔 진공테이너로 수집했습니다. 완전히 응고된 시료의 진공 용기를 실온(25oC)에서 10분간 4000rpm으로 원심분리했습니다. 수집된 혈청을 분취하여 분석할 때까지 DNase/RNase가 없는 Eppendorf 튜브 3개에 - 80°C에 보관했습니다.

4.3. 총 RNA 추출 절차 지침에 따라 혈청 샘플에서 총 RNA를 추출했습니다. 추출된 RNA는 40 µL RNase free water에 용해되었고 분취량으로 -80 ◦C에 보관되었습니다.

4.4. miRNA를 포함한 정제된 RNA의 정량 추출된 RNA의 순도와 농도는 분광광도계를 사용하여 평가됩니다. 샘플 내 RNA의 양은 260nm(A260 = 1 → 44ng/μL)의 흡광도를 사용하여 평가되었으며, RNA 순도는 260/280nm 비율의 흡광도를 사용하여 평가되었습니다.

4.5. 정량적 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 이용한 ncRNA의 역전사 및 발현 측정 4.5.1. lncRNA NNT-AS1 실시간(RT2) 첫 번째 가닥 키트는 제조업체의 지침에 따라 상보적 DNA(cDNA) 합성에 사용되었습니다. 얻은 cDNA는 -20oC에 보관되었습니다. 역전사 후 qRT-PCR을 사용하여 lncRNA NNT-AS1의 발현을 측정하여 lncRNA NNT-AS1의 발현 수준을 평가했습니다. 인간 NNT-AS1에 대한 프라이머 RT2 lncRNA qPCR 분석(LPH15988A-200, Cat. No. 330701)을 사용하였으며, 데이터는 RT2 lncRNA qPCR Assay for Human GAPDH(LPH31725A-200, Cat. No. 330701)을 내인성 대조군으로 사용합니다. 4.5.2. hsa-miR-485-5p cDNA 합성은 절차 지침에 따라 수행되었습니다. 얻은 cDNA는 -20oC에 보관되었습니다. 역전사 후, qRT-PCR을 사용하여 hsa-miR-485-5p의 발현을 측정했습니다. hsa-miR-485-5p의 발현 수준을 검출하기 위해 프라이머 hsa-hsa-miR-485-5p를 사용하고 데이터를 정규화 miRNA PCR Assay(YP00203901, Cat. No. 339306)을 내인성 대조군으로 사용합니다. 배수 변화로서의 ncRNA 발현 수준은 lncRNA NNT-AS1 및 hsa-miR-485에 대한 하우스키핑 유전자로서 GAPDH 또는 SNORD38B(hsa)를 사용하여 배수 변화(2-ΔΔCt)로서 주기 임계값(Ct) 접근법을 사용하여 계산하고 정규화했습니다. 각각 -5p. ΔCt는 연구중인 lncRNA NNT-AS1 및 hsa-miR-485-5p의 Ct 값에서 GAPDH 및 SNORD38B (hsa)의 Ct 값을 각각 공제하여 계산되었습니다.

ΔΔCt = ΔCt 암 샘플 - ΔCt 대조 샘플(ΔCt=Ct 표적 - Ct 기준) 4.5.3. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의한 HSP90 단백질 정량 HSP90은 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 ELISA에 의해 정량화되었습니다. Human HSP90 알파 고체상 샌드위치 ELISA는 일치하는 항체 쌍 사이에 결합된 표적의 양을 측정합니다. 제공된 마이크로플레이트의 웰에는 표적 특이적 항체가 미리 코팅되어 있습니다. 이러한 웰에서는 샘플, 표준물질 또는 대조물질이 고정된(포획) 항체에 결합합니다. 샌드위치는 두 번째(검출기) 항체를 추가한 후 효소-항체-표적 조합과 상호 작용하여 정량 가능한 신호를 제공하는 기질 용액을 추가하여 구성됩니다. 이 신호의 강도는 원래 물질의 타겟 농도에 비례합니다.

4.5.4. 전기화학발광 면역검정에 의한 CEA 및 CA19-9 측정 CA19-9 및 CEA 혈청 농도는 Cobas® e 602(RocheDiagnostics, North America)를 사용하여 전기화학발광 면역검정을 사용하여 측정되었습니다.

4.5.4.1. 일상적인 생화학 검사. 간 기능 검사: 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 및 혈청 알부민. 모든 참가자에 대해 신장 기능 지표인 혈청 크레아티닌과 요소가 결정되었습니다.

4.5.5. 비율 및 지수 정상 체중 = 18.5-24.9인 모든 참가자에 대해 체질량 지수(BMI) 계산(kg/m2)이 수행되었습니다. kg/m2 , 과체중 = 25-29.9 kg/m2 및 비만 = BMI가 30kg/m2 이상인 병적 비만. 혈소판-림프구 비율(PLR)은 면역 반응 관련 지표이자 체계적인 염증 바이오마커로, 염증성 질환 중증도와의 상관관계에 있어서 호중구-림프구 비율보다 우수합니다.