歯周炎におけるマイクロバイオームとプロテオームのマッピング

研究対象者: 2017 年の歯周病およびインプラント周囲の疾患と状態の分類に関する世界ワークショップによると、ステージ III、グレード C の歯周炎を患う全身的に健康で非喫煙の患者 3 名がこの研究に含まれました。 臨床歯周測定には、プロービング深さ（PD）、臨床的付着喪失（CAL）、プロービング時の出血の二値スコア（BOP +/-）、歯肉指数（GI）、およびプラーク指数（PI）が含まれていました。 すべての臨床パラメーターは、手動歯周プローブを使用して、第 3 大臼歯を除く 1 歯あたり 6 つのポイント (近心頬側、頬側、遠隔頬側、近心口蓋口蓋、および遠心口蓋) で 1 人の研究者 (B.A) によって記録されました。 歯間部位における X 線撮影による骨損失 (RBL) の割合は、デジタル パノラマ X 線写真上で、骨レベルとセメント - エナメル質接合部の間の距離と歯根の長さの比として計算されました。

サンプリング: 臨床歯周記録の 1 日後に、唾液、血清、歯肉溝液 (GCF)、および歯肉縁下のプラークのサンプルを収集しました。 すべてのサンプルは午前 8 時 30 分から午前 10 時 30 分の間に採取されました。

まず、刺激されていない唾液サンプル全体を収集しました。 参加者には、唾液採取の2時間前から飲食（水を除く）、ガム、歯磨き、デンタルフロスを控えるよう求められた。 次に、被験者に唾液を口底に溜めさせ、その唾液をファルコンチューブに受動的に5分間排出させ、その後直接-80℃で保存するように依頼した。 分析当日、解凍した唾液 1 mL を 4000 rpm、4℃で 20 分間遠心分離しました。

血清サンプルを得るために、標準的な静脈穿刺法により肘前静脈から静脈血 5 ml を採取しました。 血清を4℃、1,500gで15分間の遠心分離によって単離し、その後直ちに凍結して-80℃で保存した。

GCF は、第 3 大臼歯を除く 1 歯当たり 6 つの部位 (近心頬側、頬側、遠心頬側、近心口蓋側、口蓋側、および遠心口蓋側) から滅菌紙片を介して収集されました。 わずかな抵抗が生じるまで紙片をポケットの中に置き、30 秒間放置しました。 吸収された液体の量は、校正された電子機器を使用して測定されました。 各歯からの 6 つの GCF ストリップを空のエッペンドルフ チューブに直接入れ、分析まで -80℃ で保管しました。 分析当日、ストリップをエッペンドルフチューブ内の480μL PBSに再懸濁した。 サンプルを 4℃、600 rpm で一晩振盪し、次に 4℃、4000 rpm で 60 分間遠心分離しました。

歯肉縁下のプラークは、第 3 大臼歯を除く 1 歯あたり 6 つの部位（近心頬側、頬側、遠心頬側、近心口蓋、口蓋側、および遠心口蓋側）に 2 つの標準化されたペーパー ポイント（no:30）を挿入することによって収集されました。 2 つのペーパーポイントをポケットに置き、10 秒間放置しました。 象限ごとの各歯からのペーパーポイントを空の Falcon チューブに直接入れ、分析まで -80°C で保管しました。 分析当日、各歯垢サンプルは、複数の歯からの物質をプールし、Falcon チューブ内のストリップあたり 50 μL の PBS に再懸濁することによって取得されました。 サンプルを 4℃、600 rpm で一晩振盪し、次にベンチトップボルテクサーで 1 分間ボルテックスし、1 分間超音波処理しました。 次いで、それを６０分間遠心分離した。 4000 rpm、4℃。 1 mL の上清を収集し、16,100 x g、4℃で 10 分間の追加の遠心分離ステップを行った後、さらなる分析のためにペレットを収集しました。

DNA 抽出と定量: GenElute 細菌ゲノム DNA キットを確立されたプロトコールに従って使用し、1 mL の唾液、ペーパーポイント抽出物、および血清から DNA を抽出しました。 サンプル濃度は、Qubit 4 蛍光光度計と Qubit™ dsDNA HS Assay Kit を使用して定量されました。

ライブラリーの調製と配列決定: 確立されたプロトコールに従って、次世代配列決定用の DNA ライブラリーを調製しました。 配列決定は、Illumina NovaSeq 6000 プラットフォーム 2x150b で実行されました。

微生物叢のバイオインフォマティクス分析: この手順には、分類学的分析におけるアルファ多様性、ベータ多様性、および LDA 効果サイズの評価が含まれます。

プロテオミクス分析: 確立されたプロトコールに従って定量的プロテオミクスを実施しました。 ReproSil-Pur C18-AQ 樹脂が充填された 15 cm、直径 75 μm のシリカ エミッターを備えた Thermo Scientific EASY-nLC 1200 システムを使用して、ペプチドを分離しました。 タンパク質の同定は、Scaffold v4.0 を使用して実行されました。 MS データは、Homo sapiens Uniprot データベース、260 配列 MS 汚染物質データベース、およびデコイとしての逆配列を含むカスタマイズされたデータベースに対して Mascot を使用して検索されました。 検索結果は検証のために Scaffold にインポートされ、フィルターは少なくとも 2 つのペプチドでタンパク質誤検出率 3.0%、ペプチド誤検出率 1.0% に設定されました。

調節タンパク質の機能解析と統計解析: R ソフトウェアとclusterProfiler パッケージを使用して濃縮解析を実施しました。 遺伝子オントロジーの用語は、「Biological Process」データベースから特定され、超幾何分布を使用して統計的有意性によってランク付けされました。 Benjamini-Hochberg 補正を適用し、有意性閾値を p 値 < 0.01 および q 値 < 0.05 に設定しました。