Mikrobiom- og proteomkortlægning ved paradentose

Undersøgelsespopulation: Ifølge 2017 World Workshop om klassificering af periodontale og peri-implantatsygdomme og tilstande blev 3 systemisk sunde og ikke-rygende patienter med stadium III, grad C parodontitis inkluderet i denne undersøgelse. Kliniske parodontale målinger omfattede sonderingsdybde (PD), klinisk tilknytningstab (CAL), dikotomisk scoring af blødning ved sondering (BOP +/-), gingivalindeks (GI) og plakindeks (PI). Alle kliniske parametre blev registreret på seks punkter (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal palatal og distopalatal) pr. tand, undtagen 3. kindtænder, af en enkelt investigator (B.A) ved anvendelse af en manuel periodontal probe. Procentdelen af ​​radiografisk knogletab (RBL) på de interproksimale steder blev beregnet på de digitale panorama-røntgenbilleder som forholdet mellem afstanden mellem knogleniveau og cemento-emaljeforbindelsen og længden af ​​roden.

Prøveudtagning: Spyt-, serum-, gingival crevicular fluid (GCF) og subgingival plaque-prøver blev indsamlet 1 dag efter de kliniske periodontale optagelser. Alle prøver blev taget om morgenen mellem 8:30 og 10:30.

For det første blev de hele ustimulerede spytprøver indsamlet. Deltagerne blev bedt om at afstå fra at spise, drikke (undtagen vand), tyggegummi, børste og bruge tandtråd 2 timer før spytopsamling. Derefter blev de bedt om at lade spyttet samle sig i deres mundbund og lade spyttet passivt dræne ind i et falkerør, 5 minutter, som derefter blev opbevaret direkte ved -80°C. På analysedagen blev 1 ml optøet spyt centrifugeret ved 4000 rpm ved 4°C i 20 minutter.

For at opnå serumprøver blev 5 ml venøst ​​blod udtaget fra den antecubitale vene ved en standard venepunkturmetode. Serum blev isoleret ved centrifugering ved 1.500 g i 15 minutter ved 4°C og derefter straks frosset og opbevaret ved -80°C.

GCF blev opsamlet fra de seks steder (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal, palatal og distopalatal) pr. tand, undtagen 3. kindtænder, via sterile papirstrimler. En papirstrimmel blev anbragt inde i lommen, indtil der blev mødt en lille modstand og blev efterladt der i 30 sekunder. Det absorberede væskevolumen blev målt med et kalibreret elektronisk instrument. Seks GCF-strimler fra hver tand blev anbragt direkte i et tomt Eppendorf-rør og opbevaret ved -80°C indtil analyse. På analysedagen blev strimler resuspenderet i 480 μL PBS i et Eppendorf-rør. Prøven blev rystet natten over ved 600 rpm ved 4°C og derefter centrifugeret i 60 minutter ved 4000 rpm ved 4°C.

Subgingival plak blev opsamlet ved at indsætte to standardiserede papirpunkter (nr. 30) på seks steder (mesiobukkal, bukkal, distobukal, mesiopalatal, palatal og distopalatal) pr. tand, undtagen den 3. kindtand. To papirpunkter blev anbragt i lommen og efterladt i 10 sekunder. Papirpunkter fra hver tand pr. kvadrant blev anbragt direkte i et tomt Falcon-rør og opbevaret ved -80°C indtil analyse. På analysedagen blev hver plakprøve opnået ved at samle materiale fra flere tænder og resuspendere det i 50 μL PBS pr. strimmel i et Falcon-rør. Prøven blev rystet natten over ved 600 rpm ved 4°C, derefter vortexbehandlet i 1 minut på en bordhvirvelmaskine og sonikeret i 1 min. Det blev derefter centrifugeret i 60 min. ved 4000 rpm ved 4°C. 1 ml af supernatanten blev opsamlet til et yderligere centrifugetrin ved 16.100 x g i 10 minutter ved 4°C, før pellets blev opsamlet til yderligere analyse.

DNA-ekstraktion og kvantificering: DNA blev ekstraheret fra 1 ml spyt, papirpunktekstrakter og serum under anvendelse af GenElute bakterielle genomiske DNA-kit i henhold til etablerede protokoller. Prøvekoncentrationer blev kvantificeret ved anvendelse af et Qubit 4 fluorometer og Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Biblioteksforberedelse og sekventering: DNA-biblioteker blev forberedt til næste generations sekventering i henhold til de etablerede protokoller. Sekventering blev udført på en Illumina NovaSeq 6000 platform 2x150b.

Bioinformatikanalyse for mikrobiota: Denne procedure inkluderede vurderinger af alfa-diversitet, beta-diversitet og LDA-effektstørrelse i den taksonomiske analyse.

Proteomics analyse: Kvantitativ proteomics blev udført i henhold til de etablerede protokoller. Peptider blev adskilt under anvendelse af et Thermo Scientific EASY-nLC 1200-system med en 15 cm, 75 µm-diameter silica-emitter pakket med ReproSil-Pur C18-AQ-harpiks. Proteinidentifikation blev udført ved brug af Scaffold v4.0. MS-data blev søgt med Mascot mod en tilpasset database, som inkluderede Homo sapiens Uniprot-databasen, en 260-sekvens MS-kontaminantdatabase og omvendte sekvenser som et lokkemiddel. Søgeresultater blev importeret til Scaffold til validering med filtre indstillet til 3,0 % proteinfalsk opdagelsesrate med et minimum af 2 peptider og en 1,0 % falsk opdagelsesrate for peptider.

Funktionel analyse af regulerede proteiner og statistisk analyse: Vi udførte berigelsesanalyse ved hjælp af R-softwaren og clusterProfiler-pakken. Genontologi-termer blev identificeret fra 'Biological Process'-databasen og rangeret efter statistisk signifikans ved hjælp af hypergeometrisk fordeling. Benjamini-Hochberg-korrektion blev anvendt med signifikansgrænser sat til p-værdi < 0,01 og q-værdi < 0,05.