Microbioom en proteoom in kaart brengen bij parodontitis

Onderzoekspopulatie: Volgens de World Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Condities van 2017 werden 3 systemisch gezonde en niet-rokende patiënten met stadium III, graad C parodontitis in dit onderzoek opgenomen. Klinische parodontale metingen omvatten de diepte van het sonderen (PD), verlies van klinische hechting (CAL), de dichotome score van bloeding bij sonderen (BOP +/-), gingivale index (GI) en plaque-index (PI). Alle klinische parameters werden geregistreerd op zes punten (mesiobuccaal, buccaal, distobuccaal, mesiopalatinaal palatinaal en distopalataal) per tand, behalve de derde kiezen, door één onderzoeker (B.A) met behulp van een handmatige parodontale sonde. Het percentage radiografisch botverlies (RBL) op de interproximale plaatsen werd berekend op de digitale panoramische röntgenfoto's als de verhouding van de afstand tussen botniveau en de cement-glazuurverbinding tot de lengte van de wortel.

Bemonstering: Speeksel, serum, gingivale creviculaire vloeistof (GCF) en subgingivale plaquemonsters werden 1 dag na de klinische parodontale opnames verzameld. Alle monsters werden 's morgens tussen 8.30 en 10.30 uur verkregen.

Eerst werden de volledige ongestimuleerde speekselmonsters verzameld. De deelnemers werd gevraagd om 2 uur vóór de speekselafname af te zien van eten, drinken (behalve water), kauwgom, poetsen en flossen. Vervolgens werd hen gevraagd het speeksel in de mondbodem te laten ophopen en het speeksel passief in een valkenbuisje te laten wegvloeien, gedurende 5 minuten, die vervolgens direct bij -80°C werd bewaard. Op de dag van analyse werd 1 ml ontdooid speeksel gedurende 20 minuten bij 4000 rpm en 4°C gecentrifugeerd.

Om serummonsters te verkrijgen werd 5 ml veneus bloed uit de antecubitale ader genomen door middel van een standaard venapunctiemethode. Het serum werd geïsoleerd door centrifugatie bij 1500 g gedurende 15 minuten bij 4°C en vervolgens onmiddellijk ingevroren en bewaard bij -80°C.

GCF werd verzameld van de zes plaatsen (mesiobuccaal, buccaal, distobuccaal, mesiopalataal, palataal en distopalataal) per tand, behalve de derde kiezen, via steriele papieren strips. Een papieren strook werd in de zak geplaatst totdat er een lichte weerstand werd ondervonden en werd daar gedurende 30 seconden gelaten. Het geabsorbeerde vloeistofvolume werd gemeten met een gekalibreerd elektronisch instrument. Zes GCF-strips van elke tand werden rechtstreeks in een lege Eppendorf-buis geplaatst en tot analyse bij -80°C bewaard. Op de dag van analyse werden de strips opnieuw gesuspendeerd in 480 μl PBS in een Eppendorf-buisje. Het monster werd een nacht geschud bij 600 rpm bij 4°C en vervolgens 60 minuten bij 4000 rpm bij 4°C gecentrifugeerd.

Subgingivale plaque werd verzameld door twee gestandaardiseerde paperpoints (nr.:30) in te brengen op zes plaatsen (mesiobuccaal, buccaal, distobuccaal, mesiopalataal, palataal en distopalataal) per tand, behalve de derde kiezen. Twee papieren punten werden in de zak geplaatst en gedurende 10 seconden op hun plaats gelaten. Papierpunten van elke tand per kwadrant werden direct in een lege Falcon-buis geplaatst en tot analyse bij -80°C bewaard. Op de dag van analyse werd elk plaquemonster verkregen door materiaal van meerdere tanden samen te voegen en dit in 50 μl PBS per strip in een Falcon-buis te resuspenderen. Het monster werd een nacht geschud bij 600 rpm bij 4°C, vervolgens gedurende 1 minuut gewerveld op een tafelvortexapparaat en gedurende 1 minuut gesoniceerd. Vervolgens werd het gedurende 60 minuten gecentrifugeerd. bij 4000 tpm bij 4°C. 1 ml van het supernatant werd verzameld voor een extra centrifugestap bij 16.100 x g gedurende 10 minuten bij 4°C voordat pellets werden verzameld voor verdere analyse.

DNA-extractie en kwantificering: DNA werd geëxtraheerd uit 1 ml speeksel, paperpoint-extracten en serum met behulp van de GenElute bacteriële genomische DNA-kit volgens vastgestelde protocollen. Monsterconcentraties werden gekwantificeerd met behulp van een Qubit 4 fluorometer en de Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Voorbereiding en sequentiëring van bibliotheken: DNA-bibliotheken werden voorbereid voor sequencing van de volgende generatie volgens de vastgestelde protocollen. Sequencing werd uitgevoerd op een Illumina NovaSeq 6000-platform 2x150b.

Bio-informatica-analyse voor microbiota: Deze procedure omvatte beoordelingen van alfa-diversiteit, bèta-diversiteit en LDA-effectgrootte in de taxonomische analyse.

Proteomics-analyse: Kwantitatieve proteomics werden uitgevoerd volgens de vastgestelde protocollen. Peptiden werden gescheiden met behulp van een Thermo Scientific EASY-nLC 1200-systeem met een silica-emitter van 15 cm, 75 µm diameter, gepakt met ReproSil-Pur C18-AQ-hars. Eiwitidentificatie werd uitgevoerd met behulp van Scaffold v4.0. MS-gegevens werden met Mascot doorzocht in een aangepaste database, die de Homo sapiens Uniprot-database, een database met MS-verontreinigingen met 260 sequenties en omgekeerde sequenties als lokaas omvatte. Zoekresultaten werden ter validatie in Scaffold geïmporteerd, met filters ingesteld op 3,0% valse ontdekkingspercentages van eiwitten met een minimum van 2 peptiden, en een percentage valse ontdekkingen van 1,0% peptiden.

Functionele analyse van gereguleerde eiwitten en statistische analyse: we hebben verrijkingsanalyses uitgevoerd met behulp van de R-software en het clusterProfiler-pakket. Gene Ontology-termen werden geïdentificeerd uit de 'Biological Process'-database en gerangschikt op statistische significantie met behulp van hypergeometrische distributie. Benjamini-Hochberg-correctie werd toegepast, waarbij significantiedrempels werden vastgesteld op p-waarde <0,01 en q-waarde <0,05.