Mapeamento de microbioma e proteoma na periodontite

População do estudo: De acordo com o Workshop Mundial sobre Classificação de Doenças e Condições Periodontais e Peri-implantares de 2017, 3 pacientes sistemicamente saudáveis ​​e não fumantes com periodontite em estágio III, grau C foram incluídos neste estudo. As medidas clínicas periodontais incluíram profundidade de sondagem (PD), perda de inserção clínica (CAL), pontuação dicotômica de sangramento à sondagem (BOP +/-), índice gengival (GI) e índice de placa (PI). Todos os parâmetros clínicos foram registrados em seis pontos (mesiovestibular, bucal, distovestibular, mesiopalatino palatino e distopalatal) por dente, exceto os terceiros molares, por um único investigador (B.A) usando uma sonda periodontal manual. A porcentagem de perda óssea radiográfica (RBL) nos locais interproximais foi calculada nas radiografias panorâmicas digitais como a razão entre a distância entre o nível ósseo e a junção amelo-cementária e o comprimento da raiz.

Amostragem: Amostras de saliva, soro, fluido crevicular gengival (FCG) e placa subgengival foram coletadas 1 dia após os registros clínicos periodontais. Todas as amostras foram obtidas no período da manhã, entre 8h30 e 10h30.

Primeiramente, foram coletadas amostras completas de saliva não estimulada. Os participantes foram orientados a abster-se de comer, beber (exceto água), mascar chiclete, escovar os dentes e usar fio dental 2 horas antes da coleta de saliva. Em seguida, eles foram solicitados a deixar a saliva acumular-se no assoalho da boca e a permitir que a saliva drenasse passivamente para um tubo Falcon, por 5 minutos, que foi então armazenado diretamente a -80°C. No dia da análise, 1 mL de saliva descongelada foi centrifugado a 4.000 rpm a 4°C por 20 minutos.

Para obter amostras de soro, foram retirados 5 ml de sangue venoso da veia antecubital por método de punção venosa padrão. O soro foi isolado por centrifugação a 1.500 g por 15 minutos a 4°C e imediatamente congelado e armazenado a -80°C.

O GCF foi coletado dos seis locais (mesiovestibular, bucal, distovestibular, mesiopalatal, palatino e distopalatal) por dente, exceto os terceiros molares, por meio de tiras de papel estéreis. Uma tira de papel foi colocada dentro do bolso até encontrar leve resistência e ali deixada por 30 segundos. O volume de fluido absorvido foi medido com um instrumento eletrônico calibrado. Seis tiras de GCF de cada dente foram colocadas diretamente em um tubo Eppendorf vazio e armazenadas a -80°C até a análise. No dia da análise, as tiras foram ressuspensas em 480 μL de PBS em tubo Eppendorf. A amostra foi agitada durante a noite a 600 rpm a 4°C, depois centrifugada durante 60 minutos a 4000 rpm a 4°C.

A placa subgengival foi coletada inserindo dois pontos de papel padronizados (nº:30) em seis locais (mesiovestibular, vestibular, distovestibular, mesiopalatal, palatino e distopalatal) por dente, exceto nos terceiros molares. Duas pontas de papel foram colocadas no bolso e deixadas no local por 10 segundos. Pontas de papel de cada dente por quadrante foram colocadas diretamente em um tubo Falcon vazio e armazenadas a -80°C até a análise. No dia da análise, cada amostra de placa foi obtida reunindo material de vários dentes e ressuspendendo-o em 50 μL de PBS por tira em um tubo Falcon. A amostra foi agitada durante a noite a 600 rpm a 4°C, depois agitada em vórtice durante 1 minuto num vórtex de bancada e sonicada durante 1 min. Em seguida foi centrifugado por 60 min. a 4000 rpm a 4°C. 1 mL do sobrenadante foi coletado para uma etapa adicional de centrífuga a 16.100 x g por 10 minutos a 4°C antes dos pellets serem coletados para análise adicional.

Extração e quantificação de DNA: O DNA foi extraído de 1 mL de saliva, extratos de pontas de papel e soro usando o kit de DNA genômico bacteriano GenElute de acordo com os protocolos estabelecidos. As concentrações das amostras foram quantificadas usando um fluorômetro Qubit 4 e o Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Preparação e Sequenciamento de Bibliotecas: Bibliotecas de DNA foram preparadas para sequenciamento de próxima geração de acordo com os protocolos estabelecidos. O sequenciamento foi realizado em uma plataforma Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Análise Bioinformática para Microbiota: Este procedimento incluiu avaliações de diversidade alfa, diversidade beta e tamanho do efeito LDA na análise taxonômica.

Análise proteômica: A proteômica quantitativa foi realizada de acordo com os protocolos estabelecidos. Os peptídeos foram separados usando um sistema Thermo Scientific EASY-nLC 1200 com um emissor de sílica de 15 cm e 75 µm de diâmetro embalado com resina ReproSil-Pur C18-AQ. A identificação de proteínas foi realizada utilizando Scaffold v4.0. Os dados de MS foram pesquisados ​​com Mascot em um banco de dados personalizado, que incluía o banco de dados Homo sapiens Uniprot, um banco de dados de contaminantes de MS de 260 sequências e sequências invertidas como isca. Os resultados da pesquisa foram importados para o Scaffold para validação, com filtros definidos para uma taxa de falsa descoberta de proteína de 3,0% com um mínimo de 2 peptídeos e uma taxa de falsa descoberta de peptídeo de 1,0%.

Análise Funcional de Proteínas Reguladas e Análise Estatística: Realizamos análise de enriquecimento usando o software R e o pacote clusterProfiler. Os termos da Gene Ontology foram identificados no banco de dados 'Biological Process' e classificados por significância estatística usando distribuição hipergeométrica. Foi aplicada a correção de Benjamini-Hochberg, com limites de significância fixados em valor p < 0,01 e valor q < 0,05.