Mikrobiom og proteomkartlegging ved periodontitt

Studiepopulasjon: I følge 2017 World Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Conditions, ble 3 systemisk friske og ikke-røykende pasienter med stadium III, grad C periodontitt inkludert i denne studien. Kliniske periodontale målinger inkluderte sonderingsdybde (PD), klinisk tilknytningstap (CAL), den dikotome skåringen av blødning ved sondering (BOP +/-), gingivalindeks (GI) og plakkindeks (PI). Alle kliniske parametere ble registrert på seks punkter (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal palatal og distopalatal) per tann, bortsett fra 3. molarer, av en enkelt etterforsker (B.A) ved bruk av en manuell periodontal probe. Prosentandelen av radiografisk bentap (RBL) på de interproksimale stedene ble beregnet på de digitale panorama røntgenbildene som forholdet mellom avstanden mellom bennivå og semento-emaljekrysset og lengden av roten.

Prøvetaking: Spytt, serum, gingival crevicular fluid (GCF) og subgingival plakkprøver ble tatt 1 dag etter de kliniske periodontale registreringene. Alle prøvene ble tatt om morgenen mellom 8:30 og 10:30.

Først ble de hele ustimulerte spyttprøvene samlet inn. Deltakerne ble bedt om å avstå fra å spise, drikke (unntatt vann), tygge tyggegummi, pusse og bruke tanntråd 2 timer før spyttoppsamling. Deretter ble de bedt om å la spyttet samle seg i munnbunnen og la spyttet renne passivt inn i et falkerør, 5 minutter som deretter ble lagret direkte ved -80°C. På analysedagen ble 1 ml tint spytt sentrifugert ved 4000 rpm ved 4°C i 20 minutter.

For å få serumprøver ble det tatt 5 ml veneblod fra antecubitalvenen ved en standard venepunkturmetode. Serum ble isolert ved sentrifugering ved 1500 g i 15 minutter ved 4°C og deretter umiddelbart frosset og lagret ved -80°C.

GCF ble samlet inn fra de seks stedene (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal, palatal og distopalatal) per tann, bortsett fra den tredje molarene, via sterile papirstrimler. En papirstrimmel ble plassert inne i lommen til en liten motstand ble møtt og ble stående der i 30 sekunder. Det absorberte væskevolumet ble målt med et kalibrert elektronisk instrument. Seks GCF-strimler fra hver tann ble plassert direkte i et tomt Eppendorf-rør og lagret ved -80°C frem til analyse. På analysedagen ble strimler resuspendert i 480 μL PBS i et Eppendorf-rør. Prøven ble ristet over natten ved 600 rpm ved 4°C, deretter sentrifugert i 60 minutter ved 4000 rpm ved 4°C.

Subgingival plakk ble samlet ved å sette inn to standardiserte papirpunkter (nr:30) på seks steder (mesiobukkal, bukkal, distobukal, mesiopalatal, palatal og distopalatal) per tann, bortsett fra 3. molarer. To papirpunkter ble plassert i lommen og ble stående i 10 sekunder. Papirpunkter fra hver tann per kvadrant ble plassert direkte i et tomt Falcon-rør og lagret ved -80°C frem til analyse. På analysedagen ble hver plakkprøve oppnådd ved å samle materiale fra flere tenner og resuspendere det i 50 μL PBS per stripe i et Falcon-rør. Prøven ble ristet over natten ved 600 rpm ved 4°C, deretter vortexet i 1 minutt på en benchtop vortexer og sonikert i 1 min. Den ble deretter sentrifugert i 60 min. ved 4000 rpm ved 4°C. 1 mL av supernatanten ble samlet for et ekstra sentrifugetrinn ved 16 100 x g i 10 minutter ved 4°C før pellets ble samlet for videre analyse.

DNA-ekstraksjon og kvantifisering: DNA ble ekstrahert fra 1 mL spytt, papirpunktekstrakter og serum ved bruk av GenElute bakteriell genomisk DNA-sett i henhold til etablerte protokoller. Prøvekonsentrasjoner ble kvantifisert ved å bruke et Qubit 4-fluorometer og Qubit™ dsDNA HS-analysesettet.

Bibliotekforberedelse og sekvensering: DNA-biblioteker ble forberedt for neste generasjons sekvensering i henhold til de etablerte protokollene. Sekvensering ble utført på en Illumina NovaSeq 6000-plattform 2x150b.

Bioinformatikkanalyse for mikrobiota: Denne prosedyren inkluderte vurderinger av alfa-diversitet, beta-diversitet og LDA-effektstørrelse i den taksonomiske analysen.

Proteomikkanalyse: Kvantitativ proteomikk ble utført i henhold til de etablerte protokollene. Peptidene ble separert ved å bruke et Thermo Scientific EASY-nLC 1200-system med en 15 cm, 75 µm-diameter silikaemitter pakket med ReproSil-Pur C18-AQ-harpiks. Proteinidentifikasjon ble utført ved bruk av Scaffold v4.0. MS-data ble søkt med Mascot mot en tilpasset database, som inkluderte Homo sapiens Uniprot-databasen, en 260-sekvenser MS-forurensningsdatabase og reverserte sekvenser som et lokkemiddel. Søkeresultater ble importert til Scaffold for validering, med filtre satt til 3,0 % falsk oppdagelsesrate for proteiner med minimum 2 peptider og 1,0 % falsk oppdagelsesrate for peptider.

Funksjonell analyse av regulerte proteiner og statistisk analyse: Vi utførte anrikningsanalyse ved å bruke R-programvaren og clusterProfiler-pakken. Gene Ontology-termer ble identifisert fra 'Biological Process'-databasen og rangert etter statistisk signifikans ved bruk av hypergeometrisk distribusjon. Benjamini-Hochberg-korreksjon ble brukt, med signifikansgrenser satt til p-verdi < 0,01 og q-verdi < 0,05.