Mappatura del microbioma e del proteoma nella parodontite

Popolazione in studio: secondo il Workshop mondiale del 2017 sulla classificazione delle malattie e condizioni parodontali e perimplantari, in questo studio sono stati inclusi 3 pazienti sistemicamente sani e non fumatori con parodontite di stadio III, grado C. Le misurazioni cliniche parodontali includevano la profondità di sondaggio (PD), la perdita di attacco clinico (CAL), il punteggio dicotomico del sanguinamento al sondaggio (BOP +/-), l'indice gengivale (GI) e l'indice di placca (PI). Tutti i parametri clinici sono stati registrati in sei punti (mesiobuccale, vestibolare, distobuccale, mesiopalatale palatale e distopalatale) per dente, ad eccezione dei terzi molari, da un singolo sperimentatore (B.A) utilizzando una sonda parodontale manuale. La percentuale di perdita ossea radiografica (RBL) nei siti interprossimali è stata calcolata sulle radiografie panoramiche digitali come rapporto tra la distanza tra il livello dell'osso e la giunzione amelo-cementizia e la lunghezza della radice.

Campionamento: campioni di saliva, siero, liquido crevicolare gengivale (GCF) e placca sottogengivale sono stati raccolti 1 giorno dopo le registrazioni cliniche parodontali. Tutti i campioni sono stati ottenuti la mattina tra le 8:30 e le 10:30.

Innanzitutto sono stati raccolti tutti i campioni di saliva non stimolata. Ai partecipanti è stato chiesto di astenersi dal mangiare, bere (tranne l'acqua), masticare gomme, lavarsi i denti e usare il filo interdentale 2 ore prima della raccolta della saliva. Successivamente è stato chiesto loro di lasciare che la saliva si accumulasse nel pavimento della bocca e di consentire alla saliva di defluire passivamente in una provetta Falcon, per 5 minuti, che è stata poi conservata direttamente a -80°C. Il giorno dell'analisi, 1 ml di saliva scongelata è stata centrifugata a 4000 giri/min a 4°C per 20 minuti.

Per ottenere campioni di siero, sono stati prelevati 5 ml di sangue venoso dalla vena antecubitale mediante un metodo di venipuntura standard. Il siero è stato isolato mediante centrifugazione a 1.500 g per 15 minuti a 4°C e poi immediatamente congelato e conservato a -80°C.

Il GCF è stato raccolto dai sei siti (mesiobuccale, vestibolare, distobuccale, mesiopalatale, palatale e distopalatale) per dente, ad eccezione dei terzi molari, tramite strisce di carta sterile. Una striscia di carta è stata inserita all'interno della tasca finché non si è incontrata una leggera resistenza e è stata lasciata lì per 30 secondi. Il volume del fluido assorbito è stato misurato con uno strumento elettronico calibrato. Sei strisce GCF da ciascun dente sono state posizionate direttamente in una provetta Eppendorf vuota e conservate a -80°C fino all'analisi. Il giorno dell'analisi, le strisce sono state risospese in 480 μL di PBS in una provetta Eppendorf. Il campione è stato agitato per una notte a 600 giri al minuto a 4°C, quindi centrifugato per 60 minuti a 4000 giri al minuto a 4°C.

La placca sottogengivale è stata raccolta inserendo due punti di carta standardizzati (n. 30) in sei siti (mesiobuccale, vestibolare, distobuccale, mesiopalatale, palatale e distopalatale) per dente, ad eccezione dei terzi molari. Due punti di carta sono stati inseriti nella tasca e lasciati lì per 10 secondi. I punti di carta di ciascun dente per quadrante sono stati posizionati direttamente in una provetta Falcon vuota e conservati a -80°C fino all'analisi. Il giorno dell'analisi, ciascun campione di placca è stato ottenuto raggruppando il materiale proveniente da più denti e risospendendolo in 50 μL di PBS per striscia in una provetta Falcon. Il campione è stato agitato durante la notte a 600 giri al minuto a 4°C, quindi agitato per 1 minuto su un vortex da banco e sonicato per 1 minuto. È stato poi centrifugato per 60 minuti. a 4000 giri al minuto a 4°C. 1 mL del surnatante è stato raccolto per un'ulteriore fase di centrifugazione a 16.100 x g per 10 minuti a 4°C prima di raccogliere i pellet per ulteriori analisi.

Estrazione e quantificazione del DNA: il DNA è stato estratto da 1 mL di saliva, estratti di carta e siero utilizzando il kit DNA genomico batterico GenElute secondo i protocolli stabiliti. Le concentrazioni dei campioni sono state quantificate utilizzando un fluorimetro Qubit 4 e il kit di test Qubit™ dsDNA HS.

Preparazione e sequenziamento delle librerie: le librerie di DNA sono state preparate per il sequenziamento di prossima generazione secondo i protocolli stabiliti. Il sequenziamento è stato eseguito su una piattaforma Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Analisi bioinformatica per il microbiota: questa procedura includeva valutazioni della diversità alfa, diversità beta e dimensione dell'effetto LDA nell'analisi tassonomica.

Analisi proteomica: la proteomica quantitativa è stata eseguita secondo i protocolli stabiliti. I peptidi sono stati separati utilizzando un sistema Thermo Scientific EASY-nLC 1200 con un emettitore di silice da 15 cm e 75 µm di diametro impaccato con resina ReproSil-Pur C18-AQ. L'identificazione delle proteine ​​è stata eseguita utilizzando Scaffold v4.0. I dati sulla SM sono stati ricercati con Mascot rispetto a un database personalizzato, che includeva il database Homo sapiens Uniprot, un database di contaminanti della MS con 260 sequenze e sequenze invertite come esca. I risultati della ricerca sono stati importati in Scaffold per la convalida, con filtri impostati su un tasso di false scoperte di proteine ​​del 3,0% con un minimo di 2 peptidi e un tasso di false scoperte di peptidi dell'1,0%.

Analisi funzionale delle proteine ​​regolate e analisi statistica: abbiamo condotto analisi di arricchimento utilizzando il software R e il pacchetto clusterProfiler. I termini dell'ontologia genetica sono stati identificati dal database "Biological Process" e classificati in base alla significatività statistica utilizzando la distribuzione ipergeometrica. È stata applicata la correzione Benjamini-Hochberg, con soglie di significatività fissate a valore p < 0,01 e valore q < 0,05.