Mapování mikrobiomů a proteomů u parodontitidy

Populace studie: Podle světového workshopu o klasifikaci parodontálních a periimplantátových onemocnění a stavů v roce 2017 byli do této studie zahrnuti 3 systémově zdraví a nekuřáci s parodontitidou stupně III stupně C. Klinická periodontální měření zahrnovala hloubku sondování (PD), klinickou ztrátu přilnutí (CAL), dichotomické hodnocení krvácení při sondování (BOP +/-), gingivální index (GI) a index plaku (PI). Všechny klinické parametry byly zaznamenávány v šesti bodech (meziobukální, bukální, distobukální, meziopalatinální palatinální a distopalatinální) na zub, kromě 3. molárů, jediným zkoušejícím (B.A) za použití manuální periodontální sondy. Procento radiografického úbytku kostní hmoty (RBL) v interproximálních místech bylo vypočteno na digitálních panoramatických rentgenových snímcích jako poměr vzdálenosti mezi úrovní kosti a cemento-smaltovým spojením k délce kořene.

Odběr vzorků: Vzorky slin, séra, gingivální štěrbinové tekutiny (GCF) a subgingiválního plaku byly odebrány 1 den po klinických periodontálních záznamech. Všechny vzorky byly odebrány ráno mezi 8:30 a 10:30.

Nejprve byly odebrány celé nestimulované vzorky slin. Účastníci byli požádáni, aby se 2 hodiny před odběrem slin zdrželi jídla, pití (kromě vody), žvýkání žvýkačky, kartáčování a používání zubní nitě. Poté byli požádáni, aby nechali sliny stékat v jejich dně úst a umožnili slinám pasivně odtékat do sokolí zkumavky po dobu 5 minut, která byla poté skladována přímo při -80 °C. V den analýzy byl 1 ml rozmražených slin centrifugován při 4000 otáčkách za minutu při 4 °C po dobu 20 minut.

Pro získání vzorků séra bylo standardní venepunkční metodou odebráno 5 ml žilní krve z antekubitální žíly. Sérum bylo izolováno centrifugací při 1500 g po dobu 15 minut při 4 °C a poté okamžitě zmrazeno a skladováno při -80 °C.

GCF byl odebírán ze šesti míst (meziobukální, bukální, distobukální, meziopatalální, palatinální a distopalatální) na zub, kromě 3. molárů, pomocí sterilních papírových proužků. Do kapsy byl umístěn papírový proužek, dokud nenarazil na mírný odpor, a nechal se tam 30 sekund. Absorbovaný objem tekutiny byl měřen kalibrovaným elektronickým přístrojem. Šest GCF proužků z každého zubu bylo umístěno přímo do prázdné Eppendorfovy zkumavky a skladováno při -80 °C až do analýzy. V den analýzy byly proužky resuspendovány ve 480 μl PBS v Eppendorfově zkumavce. Vzorek byl třepán přes noc při 600 otáčkách za minutu při 4 °C, poté odstřeďován po dobu 60 minut při 4000 otáčkách za minutu při 4 °C.

Subgingivální plak byl odebrán vložením dvou standardizovaných papírových bodů (č.: 30) na šest míst (meziobukální, bukální, distobukální, meziopalatinální, palatinální a distopalatální) na zub, kromě 3. molárů. Dva papírové hroty byly umístěny do kapsy a ponechány na místě po dobu 10 sekund. Papírové body z každého zubu na kvadrant byly umístěny přímo do prázdné zkumavky Falcon a skladovány při -80 °C až do analýzy. V den analýzy byl každý vzorek plaku získán spojením materiálu z více zubů a jeho resuspendováním v 50 ul PBS na proužek ve zkumavce Falcon. Vzorek byl třepán přes noc při 600 otáčkách za minutu při 4 °C, poté vortexován po dobu 1 minuty na stolním vortexu a sonikován po dobu 1 minuty. Poté byla centrifugována po dobu 60 minut. při 4000 ot./min. při 4°C. 1 ml supernatantu byl odebrán pro další krok odstřeďování při 16 100 x g po dobu 10 minut při 4 °C, než byly pelety shromážděny pro další analýzu.

Extrakce a kvantifikace DNA: DNA byla extrahována z 1 ml slin, papírových bodových extraktů a séra pomocí soupravy GenElute bakteriální genomové DNA podle zavedených protokolů. Koncentrace vzorků byly kvantifikovány pomocí fluorometru Qubit 4 a soupravy Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Příprava a sekvenování knihovny: Knihovny DNA byly připraveny pro sekvenování další generace podle zavedených protokolů. Sekvenování bylo provedeno na platformě Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Bioinformatická analýza pro mikrobiotu: Tento postup zahrnoval posouzení diverzity alfa, diverzity beta a velikosti účinku LDA v taxonomické analýze.

Proteomická analýza: Kvantitativní proteomika byla provedena podle zavedených protokolů. Peptidy byly separovány pomocí systému Thermo Scientific EASY-nLC 1200 s 15 cm, 75 um-průměr křemičitého emitoru naplněného pryskyřicí ReproSil-Pur C18-AQ. Identifikace proteinu byla provedena pomocí Scaffold v4.0. MS data byla prohledávána pomocí Mascot proti přizpůsobené databázi, která zahrnovala Homo sapiens Uniprot databázi, databázi MS kontaminantů s 260 sekvencemi a obrácené sekvence jako návnadu. Výsledky vyhledávání byly importovány do Scaffold pro ověření, s filtry nastavenými na 3,0% míru falešného objevu proteinu s minimálně 2 peptidy a 1,0% míru falešného objevu peptidu.

Funkční analýza regulovaných proteinů a statistická analýza: Provedli jsme analýzu obohacení pomocí softwaru R a balíčku clusterProfiler. Termíny genové ontologie byly identifikovány z databáze 'Biological Process' a seřazeny podle statistické významnosti pomocí hypergeometrické distribuce. Byla použita Benjamini-Hochbergova korekce s prahy významnosti nastavenými na p-hodnotu < 0,01 a q-hodnotu < 0,05.