牙周炎中的微生物组和蛋白质组图谱

研究人群：根据2017年牙周和种植体周围疾病和状况分类世界研讨会，本研究纳入了3名全身健康且不吸烟的III期C级牙周炎患者。 临床牙周测量包括探诊深度（PD）、临床附着丧失（CAL）、探诊出血二分评分（BOP+/-）、牙龈指数（GI）和菌斑指数（PI）。 除第三磨牙外，所有临床参数均由一名研究者 (B.A) 使用手动牙周探针记录每颗牙齿的六个点（近颊侧、颊侧、远侧颊侧、近腭侧腭侧和远侧腭侧）。 在数字全景X光照片上计算邻间部位的放射线骨丢失（RBL）百分比，作为骨水平和牙骨质-牙釉质交界处之间的距离与牙根长度的比率。

采样：临床牙周记录后 1 天收集唾液、血清、龈沟液 (GCF) 和龈下菌斑样本。 所有样本均在上午 8:30 至 10:30 之间采集。

首先，收集完整的未刺激唾液样本。 要求参与者在唾液收集前2小时不要进食、饮水（水除外）、嚼口香糖、刷牙和使用牙线。 然后，他们被要求让唾液积聚在口底，并让唾液被动地排入猎鹰管中，持续 5 分钟，然后直接储存在 -80°C 下。 分析当天，将 1 mL 解冻的唾液在 4°C 下以 4000 rpm 离心 20 分钟。

为了获得血清样品，通过标准静脉穿刺方法从肘前静脉抽取5ml静脉血。 通过在 4°C 下以 1,500 g 离心 15 分钟来分离血清，然后立即冷冻并储存在 -80°C 下。

通过无菌纸条从每颗牙齿的六个部位（近颊侧、颊侧、远颊侧、近腭侧、腭侧和远腭侧）收集 GCF，第三磨牙除外。 将纸条放入口袋内，直到遇到轻微阻力并放置 30 秒。 用校准的电子仪器测量吸收的液体体积。 将每颗牙齿的 6 个 GCF 条带直接放入空 Eppendorf 管中，并保存在 -80°C 直至分析。 分析当天，将试纸条重悬于 Eppendorf 管中的 480 μL PBS 中。 将样品在 4°C 下以 600 rpm 的速度振荡过夜，然后在 4°C 下以 4000 rpm 的速度离心 60 分钟。

通过在每颗牙齿（第三磨牙除外）的六个部位（近颊侧、颊侧、远颊侧、近腭侧、腭侧和远腭侧）插入两个标准化纸尖（编号：30）来收集龈下菌斑。 将两个纸点放入口袋并放置 10 秒钟。 将每个象限每颗牙齿的纸点直接放入空 Falcon 管中，并保存在 -80°C 直至分析。 在分析当天，通过汇集多颗牙齿的材料并将其重悬于 Falcon 管中每条带 50 μL PBS 中来获得每个牙菌斑样本。 将样品在 4°C 下以 600 rpm 的速度振荡过夜，然后在台式涡旋仪上涡旋 1 分钟，并超声处理 1 分钟。 然后将其离心60分钟。 4°C 下 4000 rpm。收集 1 mL 上清液，在 4°C 下以 16,100 x g 进行额外的离心步骤 10 分钟，然后收集沉淀进行进一步分析。

DNA 提取和定量：按照既定方案，使用 GenErude 细菌基因组 DNA 试剂盒从 1 mL 唾液、纸点提取物和血清中提取 DNA。 使用 Qubit 4 荧光计和 Qubit™ dsDNA HS 检测试剂盒对样品浓度进行定量。

文库制备和测序：根据既定方案制备 DNA 文库用于下一代测序。 测序在 Illumina NovaSeq 6000 平台 2x150b 上进行。

微生物群的生物信息学分析：该程序包括评估分类分析中的 α 多样性、β 多样性和 LDA 效应大小。

蛋白质组学分析：根据既定方案进行定量蛋白质组学。 使用 Thermo Scientific EASY-nLC 1200 系统分离肽，该系统配有填充有 ReproSil-Pur C18-AQ 树脂的 15 cm、75 µm 直径二氧化硅发射器。 使用Scaffold v4.0进行蛋白质鉴定。 使用 Mascot 对照定制数据库搜索 MS 数据，其中包括智人 Uniprot 数据库、260 序列 MS 污染物数据库以及作为诱饵的反向序列。 搜索结果导入 Scaffold 进行验证，过滤器设置为 3.0% 蛋白质错误发现率（至少 2 个肽）和 1.0% 肽错误发现率。

调控蛋白质的功能分析和统计分析：我们使用 R 软件和 clusterProfiler 软件包进行富集分析。 基因本体术语是从“生物过程”数据库中识别的，并使用超几何分布按统计显着性进行排序。 应用 Benjamini-Hochberg 校正，显着性阈值设置为 p 值 < 0.01 和 q 值 < 0.05。