Mikrobiomi- ja proteomikartoitus parodontiittissa

Tutkimuspopulaatio: Vuoden 2017 parodontaali- ja peri-implanttisairauksien ja -tilojen luokittelua käsittelevän World Workshopin mukaan tähän tutkimukseen osallistui kolme systeemisesti tervettä ja tupakoimatonta potilasta, joilla oli vaiheen III, asteen C parodontiitti. Kliiniset periodontaaliset mittaukset sisälsivät koetussyvyyden (PD), kliinisen kiinnittymisen menetyksen (CAL), verenvuodon kaksijakoisen pisteytyksen koetuksella (BOP +/-), ienindeksin (GI) ja plakkiindeksin (PI). Kaikki kliiniset parametrit rekisteröitiin kuudessa kohdassa (mesiobukkaalinen, bukkaalinen, distobukkinen, mesiopalataalinen palataalinen ja distopalataalinen) hammasta kohden, lukuun ottamatta 3. poskihampaat, yksi tutkija (BA) käyttämällä manuaalista parodontaalista koetinta. Radiografisen luukadon (RBL) prosenttiosuus interproksimaalisissa kohdissa laskettiin digitaalisista panoraamaröntgenkuvista luun tason ja semento-emaliliitoksen välisen etäisyyden suhteena juuren pituuteen.

Näytteenotto: Sylki-, seerumi-, gingival crevicular neste (GCF) ja subgingiva plakkinäytteet kerättiin 1 päivä kliinisen parodontaalisen tallennuksen jälkeen. Kaikki näytteet otettiin aamulla klo 8.30-10.30 välillä.

Ensin kerättiin kokonaiset stimuloimattomat sylkinäytteet. Osallistujia kehotettiin pidättymään syömisestä, juomisesta (paitsi vettä), purukumista, harjaamisesta ja hammaslangan käytöstä 2 tuntia ennen syljen keräämistä. Sitten heitä pyydettiin päästämään sylkiallas suupohjaansa ja antamaan syljen valua passiivisesti haukkaputkeen, 5 minuuttia, jota säilytettiin sitten suoraan -80 °C:ssa. Analyysipäivänä 1 ml sulatettua sylkeä sentrifugoitiin nopeudella 4000 rpm 4 °C:ssa 20 minuuttia.

Seeruminäytteiden saamiseksi otettiin 5 ml laskimoverta kyynärpäälaskimosta tavanomaisella laskimopunktiomenetelmällä. Seerumi eristettiin sentrifugoimalla 1 500 g:ssä 15 minuuttia 4 °C:ssa ja sitten jäädytettiin välittömästi ja säilytettiin -80 °C:ssa.

GCF kerättiin kuudesta kohdasta (mesiobukkaalinen, bukkaalinen, distobukkaalinen, mesiopalataalinen, palataalinen ja distopalataalinen) hammasta kohti, paitsi 3. poskihampaat, steriileillä paperiliuskoilla. Paperiliuska asetettiin taskun sisään, kunnes havaittiin pieni vastus, ja jätettiin siihen 30 sekunniksi. Absorboituneen nesteen tilavuus mitattiin kalibroidulla elektronisella instrumentilla. Kuusi GCF-liuskaa kustakin hampaasta laitettiin suoraan tyhjään Eppendorf-putkeen ja säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti. Analyysipäivänä liuskat suspendoitiin uudelleen 480 µl:aan PBS:ää Eppendorf-putkessa. Näytettä ravisteltiin yön yli nopeudella 600 rpm 4 °C:ssa, sitten sentrifugoitiin 60 minuuttia nopeudella 4000 rpm 4 °C:ssa.

Subgingivaalinen plakki kerättiin lisäämällä kaksi standardisoitua paperipistettä (nro: 30) kuuteen kohtaan (mesiobukkaalinen, bukkaalinen, distobukkaalinen, mesiopalataalinen, palataalinen ja distopalataalinen) hammasta kohti, paitsi 3. poskihampaat. Kaksi paperipistettä asetettiin taskuun ja jätettiin paikalleen 10 sekunniksi. Paperipisteet jokaisesta hampaasta kvadranttia kohti asetettiin suoraan tyhjään Falcon-putkeen ja säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti. Analyysipäivänä jokainen plakkinäyte saatiin yhdistämällä materiaalia useista hampaista ja suspendoimalla se uudelleen 50 µl:aan PBS:ää liuskaa kohti Falcon-putkessa. Näytettä ravisteltiin yön yli nopeudella 600 rpm 4 °C:ssa, sitten sitä vorteksoitiin 1 minuutti pöytäpyörrelaitteella ja sonikoitiin 1 minuutin ajan. Sitten sitä sentrifugoitiin 60 minuuttia. 4000 rpm 4 °C:ssa. 1 ml supernatanttia kerättiin lisäsentrifugivaihetta varten 16 100 x g:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa ennen kuin pelletit kerättiin lisäanalyysiä varten.

DNA:n uuttaminen ja kvantifiointi: DNA uutettiin 1 ml:sta sylkeä, paperipisteuutteita ja seerumia käyttäen GenEluten bakteerigenomista DNA-sarjaa vakiintuneiden protokollien mukaisesti. Näytekonsentraatiot määritettiin käyttämällä Qubit 4 -fluorometriä ja Qubit™ dsDNA HS Assay Kitiä.

Kirjaston valmistelu ja sekvensointi: DNA-kirjastot valmistettiin seuraavan sukupolven sekvensointia varten vakiintuneiden protokollien mukaisesti. Sekvensointi suoritettiin Illumina NovaSeq 6000 -alustalla 2x150b.

Bioinformatic Analysis for Microbiota: Tämä menettely sisälsi alfa-diversiteetin, beetan monimuotoisuuden ja LDA-vaikutuksen koon arvioinnit taksonomisessa analyysissä.

Proteomiikka-analyysi: Kvantitatiivinen proteomiikka suoritettiin vakiintuneiden protokollien mukaisesti. Peptidit erotettiin käyttämällä Thermo Scientific EASY-nLC 1200 -järjestelmää, jossa oli 15 cm, halkaisijaltaan 75 um piidioksidiemitteri, joka oli pakattu ReproSil-Pur C18-AQ -hartsilla. Proteiinitunnistus suoritettiin käyttämällä Scaffold v4.0:aa. MS-tietoja haettiin Mascotilla räätälöityä tietokantaa vastaan, joka sisälsi Homo sapiens Uniprot -tietokannan, 260-sekvenssin MS-kontaminanttien tietokannan ja käänteisiä sekvenssejä houkuttimena. Hakutulokset tuotiin Scaffoldiin validointia varten, ja suodattimet asetettiin 3,0 %:n proteiinin väärien löydösten määrään vähintään 2 peptidillä ja 1,0 %:n peptidien väärien havaitsemisprosenttiin.

Säänneltyjen proteiinien toiminnallinen analyysi ja tilastollinen analyysi: Teimme rikastusanalyysin käyttämällä R-ohjelmistoa ja clusterProfiler-pakettia. Geeniontologian termit tunnistettiin "Biological Process" -tietokannasta ja luokiteltiin tilastollisen merkitsevyyden mukaan käyttämällä hypergeometristä jakaumaa. Käytettiin Benjamini-Hochberg-korjausta, jolloin merkitsevyyskynnykset asetettiin p-arvoon < 0,01 ja q-arvoon < 0,05.