Mapowanie mikrobiomu i proteomu w zapaleniu przyzębia

Populacja badana: Zgodnie z Światowymi warsztatami dotyczącymi klasyfikacji chorób przyzębia i tkanek wokół implantów, które odbyły się w 2017 r., do badania włączono 3 ogólnie zdrowych i niepalących pacjentów z zapaleniem przyzębia w stadium III, stopnia C. Kliniczne pomiary przyzębia obejmowały głębokość sondowania (PD), kliniczną utratę przyczepu (CAL), dychotomiczną punktację krwawienia podczas sondowania (BOP +/-), wskaźnik dziąseł (GI) i wskaźnik płytki nazębnej (PI). Wszystkie parametry kliniczne rejestrowano w sześciu punktach (mezjalno-policzkowy, policzkowy, dystalno-policzkowy, mezjalno-podniebienny i podniebienny dystopijny) na ząb, z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, przez jednego badacza (B.A) przy użyciu ręcznej sondy periodontologicznej. Na podstawie cyfrowych zdjęć panoramicznych obliczono procent radiograficznych ubytków kości (RBL) w miejscach międzyzębowych jako stosunek odległości pomiędzy poziomem kości a połączeniem cementowo-szkliwnym do długości korzenia.

Pobieranie próbek: Pobrano ślinę, surowicę, płyn dziąsłowy (GCF) i płytkę poddziąsłową 1 dzień po zapisie klinicznym przyzębia. Wszystkie próbki pobrano rano w godzinach 8:30-10:30.

W pierwszej kolejności pobierano całą niestymulowaną ślinę. Uczestników poproszono o powstrzymanie się od jedzenia, picia (z wyjątkiem wody), żucia gumy, szczotkowania i nitkowania zębów na 2 godziny przed pobraniem śliny. Następnie poproszono ich, aby ślina zebrała się na dnie jamy ustnej i umożliwiła jej bierne spuszczenie do probówki typu Falcon przez 5 minut, którą następnie przechowywano bezpośrednio w temperaturze -80°C. W dniu analizy 1 ml rozmrożonej śliny odwirowano przy 4000 obr/min w temperaturze 4°C przez 20 minut.

W celu pobrania próbek surowicy pobierano 5 ml krwi żylnej z żyły łokciowej standardową metodą nakłucia żyły. Surowicę wyizolowano przez wirowanie przy 1500 g przez 15 minut w temperaturze 4°C, a następnie natychmiast zamrożono i przechowywano w temperaturze -80°C.

GCF pobierano z sześciu miejsc (mezjalno-policzkowego, policzkowego, dystalno-policzkowego, mezjalno-podniebiennego, podniebiennego i dystopijnego) z każdego zęba, z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych, za pomocą sterylnych pasków papieru. Pasek papieru umieszczono w kieszeni aż do napotkania lekkiego oporu i pozostawiono tam na 30 sekund. Objętość zaabsorbowanego płynu mierzono za pomocą skalibrowanego przyrządu elektronicznego. Sześć pasków GCF z każdego zęba umieszczono bezpośrednio w pustej probówce Eppendorfa i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. W dniu analizy paski ponownie zawieszono w 480 µl PBS w probówce Eppendorfa. Próbkę wytrząsano przez noc przy 600 obr./min w temperaturze 4°C, następnie wirowano przez 60 minut przy 4000 obr./min w temperaturze 4°C.

Płytkę poddziąsłową zebrano poprzez wprowadzenie dwóch standardowych ćwieków papierowych (nr:30) w sześciu miejscach (mezjalno-policzkowego, policzkowego, dystalno-policzkowego, mezjalno-podniebiennego, podniebiennego i dystopijnego) na każdy ząb, z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych. Do kieszeni włożono dwa papierowe punkty i pozostawiono je na 10 sekund. Papierowe kropki z każdego zęba na ćwiartkę umieszczono bezpośrednio w pustej probówce Falcon i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy. W dniu analizy każdą próbkę płytki nazębnej uzyskano poprzez połączenie materiału z wielu zębów i ponowne zawieszenie go w 50 µl PBS na pasek w probówce Falcon. Próbkę wytrząsano przez noc przy 600 obr./min. w temperaturze 4°C, następnie wirowano przez 1 minutę na wirówce laboratoryjnej i poddano działaniu ultradźwięków przez 1 minutę. Następnie wirowano przez 60 minut. przy 4000 obr/min w temperaturze 4°C. Zebrano 1 ml supernatantu do dodatkowego etapu wirowania przy 16 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C, po czym zebrano osady do dalszej analizy.

Ekstrakcja i ocena ilościowa DNA: DNA ekstrahowano z 1 ml śliny, ekstraktów papierowych i surowicy przy użyciu zestawu bakteryjnego genomowego DNA GenElute zgodnie z ustalonymi protokołami. Stężenia próbek oznaczono ilościowo przy użyciu fluorometru Qubit 4 i zestawu Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie: Biblioteki DNA przygotowano do sekwencjonowania nowej generacji zgodnie z ustalonymi protokołami. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Analiza bioinformatyczna mikrobioty: procedura ta obejmowała ocenę różnorodności alfa, różnorodności beta i wielkości efektu LDA w analizie taksonomicznej.

Analiza proteomiczna: Proteomikę ilościową przeprowadzono zgodnie z ustalonymi protokołami. Peptydy rozdzielono przy użyciu systemu Thermo Scientific EASY-nLC 1200 z emiterem krzemionkowym o średnicy 15 cm i średnicy 75 µm wypełnionym żywicą ReproSil-Pur C18-AQ. Identyfikację białek przeprowadzono przy użyciu Scaffold v4.0. Dane dotyczące MS przeszukano za pomocą programu Mascot w dostosowanej bazie danych, która obejmowała bazę danych Homo sapiens Uniprot, bazę danych dotyczącą zanieczyszczeń MS zawierającą 260 sekwencji oraz odwrócone sekwencje jako wabik. Wyniki wyszukiwania zaimportowano do Scaffold w celu sprawdzenia, przy filtrach ustawionych na 3,0% współczynnika fałszywego wykrywania białek przy minimum 2 peptydach i 1,0% współczynnika fałszywego wykrywania peptydów.

Analiza funkcjonalna białek regulowanych i analiza statystyczna: Przeprowadziliśmy analizę wzbogacania przy użyciu oprogramowania R i pakietu ClusterProfiler. Terminy z zakresu ontologii genów zidentyfikowano w bazie danych „Proces biologiczny” i uszeregowano według istotności statystycznej przy użyciu rozkładu hipergeometrycznego. Zastosowano poprawkę Benjaminiego-Hochberga, ustalając progi istotności na poziomie p < 0,01 i wartości q < 0,05.