치주염의 미생물군집과 단백질체 매핑

연구 집단: 2017년 치주 및 임플란트 주위 질환 분류에 관한 세계 워크숍에 따르면, 전신적으로 건강하고 비흡연자인 3기, C등급 치주염 환자 3명이 이 연구에 포함되었습니다. 임상적 치주 측정에는 프로빙 깊이(PD), 임상적 부착 손실(CAL), 프로빙 시 출혈의 이분형 점수(BOP +/-), 치은 지수(GI) 및 플라크 지수(PI)가 포함되었습니다. 모든 임상 변수는 수동 치주 탐침을 사용하여 한 명의 조사자(B.A)가 제3대구치를 제외하고 치아당 6개 지점(심측협측, 협측, 원위협측, 근심구개측, 원위구개측)에서 기록했습니다. 치간 부위의 방사선학적 골 손실(RBL) 비율은 디지털 파노라마 방사선 사진에서 뼈 수준과 시멘트-법랑질 접합부 사이의 거리 대 치근 길이의 비율로 계산되었습니다.

샘플링: 타액, 혈청, 치은열구액(GCF) 및 치은연하 플라크 샘플을 임상 치주 기록 후 1일에 수집했습니다. 모든 샘플은 오전 8시 30분부터 오전 10시 30분 사이에 채취되었습니다.

먼저, 자극되지 않은 전체 타액 샘플을 수집했습니다. 참가자들에게는 타액 채취 2시간 전부터 식사, 음주(물 제외), 껌 씹기, 양치질, 치실 사용을 삼가도록 요청했습니다. 그런 다음 타액이 입 바닥에 고이게 하고 타액이 팔콘 튜브로 수동적으로 배출되도록 5분간 요청한 다음 -80°C에서 직접 보관했습니다. 분석 당일 해동된 타액 1 mL를 4000 rpm, 4°C에서 20분간 원심분리하였다.

혈청 샘플을 얻기 위해 표준 정맥 천자 방법을 사용하여 전주 정맥에서 5 ml의 정맥혈을 채취했습니다. 혈청은 1,500g에서 15분간 4°C에서 원심분리하여 분리한 후 즉시 냉동하여 -80°C에서 보관했습니다.

GCF는 멸균 종이 스트립을 통해 제3대구치를 제외한 치아당 6개 부위(심측협측, 협측, 원위협측, 근심구개측, 구개측 및 원위구개측)에서 수집되었습니다. 약간의 저항이 느껴질 때까지 주머니 안에 종이 조각을 넣고 30초 동안 그대로 두었습니다. 흡수된 유체량은 보정된 전자 기기를 사용하여 측정되었습니다. 각 치아의 6개 GCF 스트립을 빈 Eppendorf 튜브에 직접 넣고 분석할 때까지 -80°C에서 보관했습니다. 분석 당일 스트립을 Eppendorf 튜브의 480 μL PBS에 재현탁했습니다. 샘플을 4°C에서 600rpm으로 밤새 진탕시킨 다음, 4°C에서 4000rpm으로 60분 동안 원심분리했습니다.

치은연하 플라크는 제3 대구치를 제외하고 치아당 6개 부위(심측협측, 협측, 원위구개측, 근심구개측, 구개측 및 원위구개측)에 2개의 표준화된 종이 포인트(30번)를 삽입하여 수집되었습니다. 두 개의 종이 포인트를 주머니에 넣고 10초 동안 그대로 두었습니다. 사분면당 각 치아의 종이 점을 빈 Falcon 튜브에 직접 넣고 분석할 때까지 -80°C에서 보관했습니다. 분석 당일, 여러 치아의 물질을 모아 Falcon 튜브에 스트립당 50μL PBS에 재현탁하여 각 플라크 샘플을 얻었습니다. 샘플을 4°C에서 600rpm으로 밤새 진탕한 후 벤치탑 볼텍서에서 1분 동안 볼텍싱하고 1분 동안 초음파 처리했습니다. 그런 다음 60분 동안 원심분리했습니다. 4°C에서 4000rpm으로. 추가 분석을 위해 펠릿을 수집하기 전에 4°C에서 10분 동안 16,100 x g에서 추가 원심분리 단계를 위해 상층액 1mL를 수집했습니다.

DNA 추출 및 정량화: 확립된 프로토콜에 따라 GenElute 박테리아 게놈 DNA 키트를 사용하여 1mL의 타액, 종이 점 추출물 및 혈청에서 DNA를 추출했습니다. 샘플 농도는 Qubit 4 형광계와 Qubit™ dsDNA HS 분석 키트를 사용하여 정량화되었습니다.

라이브러리 준비 및 시퀀싱: 확립된 프로토콜에 따라 차세대 시퀀싱을 위해 DNA 라이브러리를 준비했습니다. 시퀀싱은 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼 2x150b에서 수행되었습니다.

미생물군에 대한 생물정보학 분석: 이 절차에는 분류학적 분석에서 알파 다양성, 베타 다양성 및 LDA 효과 크기에 대한 평가가 포함되었습니다.

단백질체학 분석: 정량적 단백질체학은 확립된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. ReproSil-Pur C18-AQ 수지로 충전된 15cm, 75μm 직경의 실리카 이미터를 갖춘 Thermo Scientific EASY-nLC 1200 시스템을 사용하여 펩타이드를 분리했습니다. 단백질 식별은 Scaffold v4.0을 사용하여 수행되었습니다. MS 데이터는 Homo sapiens Uniprot 데이터베이스, 260 서열 MS 오염 물질 데이터베이스 및 미끼로서의 역순을 포함하는 맞춤형 데이터베이스에 대해 Mascot을 사용하여 검색되었습니다. 검색 결과는 검증을 위해 Scaffold로 가져왔고, 필터는 최소 2개의 펩타이드를 사용하여 3.0% 단백질 허위 발견율과 1.0% 펩타이드 허위 발견율로 설정되었습니다.

규제 단백질의 기능 분석 및 통계 분석: R 소프트웨어와 ClusterProfiler 패키지를 사용하여 농축 분석을 수행했습니다. 유전자 온톨로지 용어는 '생물학적 과정' 데이터베이스에서 식별되었으며 초기하 분포를 사용하여 통계적 유의성에 따라 순위가 매겨졌습니다. p-값 < 0.01 및 q-값 < 0.05로 설정된 유의성 임계값을 사용하여 Benjamini-Hochberg 보정이 적용되었습니다.