Mikrobiom och proteomkartläggning vid parodontit

Studiepopulation: Enligt 2017 års World Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-implant Diseases and Conditions inkluderades 3 systemiskt friska och icke-rökare patienter med stadium III, grad C parodontit i denna studie. Kliniska parodontala mätningar inkluderade sonderingsdjup (PD), klinisk anknytningsförlust (CAL), dikotom poängsättning av blödning vid sondering (BOP +/-), gingivalindex (GI) och plackindex (PI). Alla kliniska parametrar registrerades vid sex punkter (mesiobuckal, buckal, distobuckal, mesiopalatal palatal och distopalatal) per tand, förutom de 3:e molarerna, av en enda utredare (B.A) med användning av en manuell periodontal sond. Procentandelen av radiografisk benförlust (RBL) vid de interproximala platserna beräknades på de digitala panoramaröntgenbilderna som förhållandet mellan avståndet mellan bennivån och cemento-emaljövergången och längden på roten.

Provtagning: Saliv, serum, gingival crevicular fluid (GCF) och subgingival plackprover togs 1 dag efter de kliniska parodontala registreringarna. Alla prover togs på morgonen mellan 8:30-10:30.

Först samlades de hela ostimulerade salivproverna in. Deltagarna uppmanades att avstå från att äta, dricka (förutom vatten), tugga tuggummi, borsta och använda tandtråd 2 timmar före salivuppsamling. Sedan ombads de att låta saliven samlas i munbotten och låta saliven passivt rinna av i ett falkrör, 5 minuter som sedan förvarades direkt vid -80°C. På analysdagen centrifugerades 1 ml tinad saliv vid 4000 rpm vid 4°C under 20 minuter.

För att erhålla serumprov togs 5 ml venöst blod från antecubitalvenen med en standard venpunktionsmetod. Serum isolerades genom centrifugering vid 1500 g under 15 minuter vid 4°C och frystes sedan omedelbart och lagrades vid -80°C.

GCF uppsamlades från de sex ställena (mesiobuckal, buckal, distobuckal, mesiopalatal, palatal och distopalatal) per tand, förutom de 3:e molarerna, via sterila pappersremsor. En pappersremsa placerades inuti fickan tills ett lätt motstånd möttes och lämnades där i 30 sekunder. Den absorberade vätskevolymen mättes med ett kalibrerat elektroniskt instrument. Sex GCF-remsor från varje tand placerades direkt i ett tomt Eppendorf-rör och förvarades vid -80°C fram till analys. På analysdagen återsuspenderades remsor i 480 μL PBS i ett Eppendorf-rör. Provet skakades över natten vid 600 rpm vid 4°C, centrifugerades sedan i 60 minuter vid 4000 rpm vid 4°C.

Subgingival plack samlades in genom att sätta in två standardiserade papperspunkter (nr:30) på sex ställen (mesiobuckal, buckal, distobuckal, mesiopalatal, palatal och distopalatal) per tand, förutom de 3:e molarerna. Två pappersspetsar placerades i fickan och lämnades på plats i 10 sekunder. Papperspunkter från varje tand per kvadrant placerades direkt i ett tomt Falcon-rör och förvarades vid -80°C fram till analys. På analysdagen erhölls varje plackprov genom att poola material från flera tänder och återsuspendera det i 50 μL PBS per remsa i ett Falcon-rör. Provet skakades över natten vid 600 rpm vid 4°C, virvlades sedan i 1 minut på en bänkvirvel och sonikerades under 1 min. Den centrifugerades sedan under 60 min. vid 4000 rpm vid 4°C. 1 ml av supernatanten uppsamlades för ett ytterligare centrifugeringssteg vid 16 100 x g under 10 minuter vid 4°C innan pellets samlades upp för ytterligare analys.

DNA-extraktion och kvantifiering: DNA extraherades från 1 ml saliv, extrakt av papperspunkt och serum med användning av GenElute bakteriella genomiska DNA-kit enligt etablerade protokoll. Provkoncentrationer kvantifierades med användning av en Qubit 4 fluorometer och Qubit™ dsDNA HS Assay Kit.

Biblioteksberedning och sekvensering: DNA-bibliotek förbereddes för nästa generations sekvensering enligt de etablerade protokollen. Sekvensering utfördes på en Illumina NovaSeq 6000-plattform 2x150b.

Bioinformatikanalys för mikrobiota: Denna procedur inkluderade bedömningar av alfadiversitet, betadiversitet och LDA-effektstorlek i den taxonomiska analysen.

Proteomikanalys: Kvantitativ proteomik gjordes enligt de etablerade protokollen. Peptider separerades med användning av ett Thermo Scientific EASY-nLC 1200-system med en 15 cm, 75 µm-diameter kiseldioxidemitter packad med ReproSil-Pur C18-AQ-harts. Proteinidentifiering utfördes med användning av Scaffold v4.0. MS-data söktes med Mascot mot en anpassad databas, som inkluderade Homo sapiens Uniprot-databasen, en 260-sekvens MS-kontaminantdatabas och omvända sekvenser som ett lockbete. Sökresultaten importerades till Scaffold för validering, med filter inställda på 3,0 % falsk upptäckt av protein med minst 2 peptider och 1,0 % falsk upptäckt av peptider.

Funktionell analys av reglerade proteiner och statistisk analys: Vi utförde anrikningsanalys med R-programvaran och klusterProfiler-paketet. Gene Ontology-termer identifierades från databasen "Biological Process" och rangordnades efter statistisk signifikans med hjälp av hypergeometrisk fördelning. Benjamini-Hochberg-korrigering tillämpades, med signifikanströsklar satta till p-värde < 0,01 och q-värde < 0,05.