Mapeo de microbiomas y proteomas en periodontitis

Población de estudio: según el Taller mundial de 2017 sobre la clasificación de enfermedades y afecciones periodontales y periimplantarias, en este estudio se incluyeron 3 pacientes sistémicamente sanos y no fumadores con periodontitis en estadio III, grado C. Las mediciones periodontales clínicas incluyeron la profundidad de sondaje (PD), la pérdida de inserción clínica (CAL), la puntuación dicotómica de sangrado al sondaje (BOP +/-), el índice gingival (GI) y el índice de placa (PI). Todos los parámetros clínicos se registraron en seis puntos (mesiovestibular, bucal, distovestibular, mesiopalatino palatino y distopalatino) por diente, excepto los terceros molares, por un solo investigador (B.A) utilizando una sonda periodontal manual. El porcentaje de pérdida ósea radiográfica (RBL) en los sitios interproximales se calculó en las radiografías panorámicas digitales como la relación entre la distancia entre el nivel óseo y la unión cemento-esmalte y la longitud de la raíz.

Muestreo: Se recogieron muestras de saliva, suero, líquido crevicular gingival (GCF) y placa subgingival 1 día después de los registros periodontales clínicos. Todas las muestras se obtuvieron por la mañana entre las 8:30 am y las 10:30 am.

En primer lugar, se recogieron todas las muestras de saliva no estimulada. Se pidió a los participantes que se abstuvieran de comer, beber (excepto agua), mascar chicle, cepillarse los dientes y usar hilo dental 2 horas antes de la recolección de saliva. Luego se les pidió que dejaran que la saliva se acumulara en el suelo de la boca y que permitieran que la saliva drenara pasivamente en un tubo Falcon, durante 5 minutos, que luego se almacenó directamente a -80°C. El día del análisis, se centrifugó 1 ml de saliva descongelada a 4000 rpm a 4°C durante 20 minutos.

Para obtener muestras de suero, se tomaron 5 ml de sangre venosa de la vena antecubital mediante un método de punción venosa estándar. El suero se aisló por centrifugación a 1.500 g durante 15 minutos a 4°C y luego se congeló inmediatamente y se almacenó a -80°C.

El GCF se recogió de los seis sitios (mesiovestibular, bucal, distovestibular, mesiopalatino, palatino y distopalatino) por diente, excepto los terceros molares, mediante tiras de papel esterilizadas. Se colocó una tira de papel dentro del bolsillo hasta que encontró una ligera resistencia y se dejó allí durante 30 segundos. El volumen de líquido absorbido se midió con un instrumento electrónico calibrado. Se colocaron seis tiras de GCF de cada diente directamente en un tubo Eppendorf vacío y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. El día del análisis, las tiras se resuspendieron en 480 μL de PBS en un tubo Eppendorf. La muestra se agitó durante la noche a 600 rpm a 4°C y luego se centrifugó durante 60 minutos a 4000 rpm a 4°C.

La placa subgingival se recogió insertando dos puntas de papel estandarizadas (no: 30) en seis sitios (mesiovestibular, bucal, distovestibular, mesiopalatal, palatal y distopalatal) por diente, excepto los terceros molares. Se colocaron dos puntas de papel en el bolsillo y se dejaron en su lugar durante 10 segundos. Las puntas de papel de cada diente por cuadrante se colocaron directamente en un tubo Falcon vacío y se almacenaron a -80°C hasta el análisis. El día del análisis, cada muestra de placa se obtuvo agrupando material de múltiples dientes y resuspendiéndolo en 50 μl de PBS por tira en un tubo Falcon. La muestra se agitó durante la noche a 600 rpm a 4°C, luego se agitó durante 1 minuto en un agitador de vórtex de mesa y se sonicó durante 1 min. Luego se centrifugó durante 60 min. a 4000 rpm a 4°C. Se recogió 1 ml del sobrenadante para un paso de centrifugación adicional a 16.100 x g durante 10 minutos a 4 °C antes de recoger los sedimentos para su posterior análisis.

Extracción y cuantificación de ADN: el ADN se extrajo de 1 ml de saliva, extractos de puntas de papel y suero utilizando el kit de ADN genómico bacteriano GenElute según los protocolos establecidos. Las concentraciones de las muestras se cuantificaron utilizando un fluorómetro Qubit 4 y el kit de ensayo Qubit™ dsDNA HS.

Preparación de bibliotecas y secuenciación: se prepararon bibliotecas de ADN para secuenciación de próxima generación de acuerdo con los protocolos establecidos. La secuenciación se realizó en una plataforma Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Análisis bioinformático para microbiota: este procedimiento incluyó evaluaciones de diversidad alfa, diversidad beta y tamaño del efecto LDA en el análisis taxonómico.

Análisis proteómico: Los proteómicos cuantitativos se realizaron según los protocolos establecidos. Los péptidos se separaron utilizando un sistema Thermo Scientific EASY-nLC 1200 con un emisor de sílice de 15 cm y 75 µm de diámetro lleno de resina ReproSil-Pur C18-AQ. La identificación de proteínas se realizó utilizando Scaffold v4.0. Los datos de MS se buscaron con Mascot en una base de datos personalizada, que incluía la base de datos de Homo sapiens Uniprot, una base de datos de contaminantes de MS de 260 secuencias y secuencias invertidas como señuelo. Los resultados de la búsqueda se importaron a Scaffold para su validación, con filtros configurados en una tasa de descubrimiento falso de proteínas del 3,0 % con un mínimo de 2 péptidos y una tasa de descubrimiento falso de péptidos del 1,0 %.

Análisis funcional de proteínas reguladas y análisis estadístico: realizamos análisis de enriquecimiento utilizando el software R y el paquete clusterProfiler. Los términos de ontología genética se identificaron a partir de la base de datos 'Proceso biológico' y se clasificaron según su importancia estadística mediante una distribución hipergeométrica. Se aplicó la corrección de Benjamini-Hochberg, con umbrales de significancia establecidos en el valor p <0,01 y el valor q <0,05.