Mikrobiom- und Proteomkartierung bei Parodontitis

Studienpopulation: Laut dem World Workshop on the Classification of Parodontal and Periimplant Diseases and Conditions 2017 wurden drei systemisch gesunde und nicht rauchende Patienten mit Parodontitis im Stadium III, Grad C in diese Studie einbezogen. Zu den klinischen parodontalen Messungen gehörten die Sondierungstiefe (PD), der klinische Attachmentverlust (CAL), die dichotome Bewertung der Blutung bei der Sondierung (BOP +/-), der Gingivaindex (GI) und der Plaqueindex (PI). Alle klinischen Parameter wurden an sechs Punkten (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal palatinal und distopalatal) pro Zahn, mit Ausnahme der 3. Molaren, von einem einzelnen Untersucher (B.A.) mithilfe einer manuellen Parodontalsonde aufgezeichnet. Der Prozentsatz des radiologischen Knochenverlusts (RBL) an den interproximalen Stellen wurde auf den digitalen Panorama-Röntgenaufnahmen als Verhältnis des Abstands zwischen Knochenniveau und der Zement-Schmelz-Grenze zur Länge der Wurzel berechnet.

Probenahme: Einen Tag nach den klinischen parodontalen Aufzeichnungen wurden Speichel-, Serum-, Zahnfleischspaltflüssigkeits- (GCF) und subgingivale Plaqueproben entnommen. Alle Proben wurden morgens zwischen 8:30 und 10:30 Uhr entnommen.

Zunächst wurden die gesamten unstimulierten Speichelproben gesammelt. Die Teilnehmer wurden gebeten, 2 Stunden vor der Speichelsammlung auf Essen, Trinken (außer Wasser), Kaugummi kauen, Zähneputzen und Zahnseide zu verzichten. Dann wurden sie gebeten, den Speichel im Mundboden ansammeln zu lassen und den Speichel fünf Minuten lang passiv in ein Falkenröhrchen abfließen zu lassen, das dann direkt bei -80 °C gelagert wurde. Am Tag der Analyse wurde 1 ml aufgetauter Speichel 20 Minuten lang bei 4000 U/min und 4 °C zentrifugiert.

Um Serumproben zu erhalten, wurden 5 ml venöses Blut mit einer Standard-Venenpunktionsmethode aus der Vena antecubitalis entnommen. Das Serum wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 1.500 g und 4 °C isoliert und dann sofort eingefroren und bei -80 °C gelagert.

GCF wurde an den sechs Stellen (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal, palatinal und distopalatal) pro Zahn, mit Ausnahme der 3. Molaren, über sterile Papierstreifen gesammelt. Ein Papierstreifen wurde in die Tasche gesteckt, bis ein leichter Widerstand spürbar war, und dort 30 Sekunden lang belassen. Das absorbierte Flüssigkeitsvolumen wurde mit einem kalibrierten elektronischen Instrument gemessen. Sechs GCF-Streifen von jedem Zahn wurden direkt in ein leeres Eppendorf-Röhrchen gegeben und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Am Tag der Analyse wurden die Streifen in 480 μl PBS in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert. Die Probe wurde über Nacht bei 600 U/min bei 4 °C geschüttelt und dann 60 Minuten lang bei 4000 U/min bei 4 °C zentrifugiert.

Subgingivale Plaque wurde durch Einführen von zwei standardisierten Papierspitzen (Nr. 30) an sechs Stellen (mesiobukkal, bukkal, distobukkal, mesiopalatal, palatinal und distopalalal) pro Zahn, mit Ausnahme der 3. Molaren, gesammelt. Zwei Papierspitzen wurden in die Tasche gesteckt und dort 10 Sekunden lang belassen. Papierpunkte von jedem Zahn pro Quadrant wurden direkt in ein leeres Falcon-Röhrchen gelegt und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Am Tag der Analyse wurde jede Plaqueprobe gewonnen, indem Material von mehreren Zähnen gepoolt und in 50 μl PBS pro Streifen in einem Falcon-Röhrchen resuspendiert wurde. Die Probe wurde über Nacht bei 600 U/min bei 4 °C geschüttelt, dann 1 Minute lang auf einem Tischvortexer gevortext und 1 Minute lang mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurde 60 Minuten lang zentrifugiert. bei 4000 U/min bei 4°C. 1 ml des Überstands wurde für einen zusätzlichen Zentrifugenschritt bei 16.100 x g für 10 Minuten bei 4 °C gesammelt, bevor Pellets für die weitere Analyse gesammelt wurden.

DNA-Extraktion und -Quantifizierung: DNA wurde aus 1 ml Speichel, Papierspitzenextrakten und Serum mit dem GenElute-Kit für bakterielle genomische DNA gemäß etablierten Protokollen extrahiert. Die Probenkonzentrationen wurden mit einem Qubit 4-Fluorometer und dem Qubit™ dsDNA HS Assay Kit quantifiziert.

Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung: DNA-Bibliotheken wurden gemäß den etablierten Protokollen für die Next-Generation-Sequenzierung vorbereitet. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina NovaSeq 6000-Plattform 2x150b durchgeführt.

Bioinformatische Analyse für Mikrobiota: Dieses Verfahren umfasste Bewertungen der Alpha-Diversität, Beta-Diversität und der LDA-Effektgröße in der taxonomischen Analyse.

Proteomics-Analyse: Quantitative Proteomics wurden gemäß den etablierten Protokollen durchgeführt. Die Peptide wurden mit einem Thermo Scientific EASY-nLC 1200-System mit einem 15 cm großen Silica-Emitter mit 75 µm Durchmesser, gefüllt mit ReproSil-Pur C18-AQ-Harz, getrennt. Die Proteinidentifizierung wurde mit Scaffold v4.0 durchgeführt. MS-Daten wurden mit Mascot anhand einer benutzerdefinierten Datenbank durchsucht, die die Homo sapiens Uniprot-Datenbank, eine MS-Kontaminantendatenbank mit 260 Sequenzen und umgekehrte Sequenzen als Lockmittel umfasste. Die Suchergebnisse wurden zur Validierung in Scaffold importiert, wobei die Filter auf eine Rate falscher Proteinentdeckungen von 3,0 % mit mindestens 2 Peptiden und eine Rate falscher Peptidentdeckungen von 1,0 % eingestellt waren.

Funktionsanalyse regulierter Proteine ​​und statistische Analyse: Wir führten eine Anreicherungsanalyse mit der R-Software und dem ClusterProfiler-Paket durch. Begriffe der Genontologie wurden aus der Datenbank „Biological Process“ identifiziert und anhand der hypergeometrischen Verteilung nach statistischer Signifikanz eingestuft. Es wurde eine Benjamini-Hochberg-Korrektur angewendet, wobei die Signifikanzschwellen auf p-Wert < 0,01 und q-Wert < 0,05 festgelegt wurden.