Cartographie du microbiome et du protéome dans la parodontite

Population étudiée : Selon l'atelier mondial 2017 sur la classification des maladies et affections parodontales et péri-implantaires, 3 patients systémiquement sains et non-fumeurs atteints de parodontite de stade III, grade C ont été inclus dans cette étude. Les mesures parodontales cliniques comprenaient la profondeur de sondage (PD), la perte d'attache clinique (CAL), la notation dichotomique du saignement au sondage (BOP +/-), l'indice gingival (GI) et l'indice de plaque (PI). Tous les paramètres cliniques ont été enregistrés en six points (mésio-buccal, buccal, disto-buccal, mésio-palatin, palatin et distopalatin) par dent, à l'exception des 3èmes molaires, par un seul enquêteur (B.A) à l'aide d'une sonde parodontale manuelle. Le pourcentage de perte osseuse radiographique (RBL) au niveau des sites interproximaux a été calculé sur les radiographies panoramiques numériques comme le rapport de la distance entre le niveau osseux et la jonction cémento-émail à la longueur de la racine.

Échantillonnage : Des échantillons de salive, de sérum, de liquide creviculaire gingival (GCF) et de plaque sous-gingivale ont été collectés 1 jour après les enregistrements parodontaux cliniques. Tous les échantillons ont été prélevés le matin entre 8h30 et 10h30.

Tout d’abord, tous les échantillons de salive non stimulés ont été collectés. Il a été demandé aux participants de s'abstenir de manger, de boire (sauf de l'eau), de mâcher de la gomme, de se brosser les dents et de passer la soie dentaire 2 heures avant le prélèvement de salive. Il leur a ensuite été demandé de laisser la salive s'accumuler dans leur plancher buccal et de permettre à la salive de s'écouler passivement dans un tube Falcon pendant 5 minutes qui a ensuite été stocké directement à -80°C. Le jour de l'analyse, 1 mL de salive décongelée a été centrifugé à 4 000 tr/min à 4°C pendant 20 minutes.

Pour obtenir des échantillons de sérum, 5 ml de sang veineux ont été prélevés dans la veine antécubitale par une méthode de ponction veineuse standard. Le sérum a été isolé par centrifugation à 1 500 g pendant 15 minutes à 4°C puis immédiatement congelé et conservé à -80°C.

Le GCF a été collecté dans les six sites (mésio-buccal, buccal, disto-buccal, mésio-palatin, palatin et distopalatin) par dent, à l'exception des 3èmes molaires, via des bandes de papier stériles. Une bande de papier a été placée à l'intérieur de la poche jusqu'à ce qu'une légère résistance soit rencontrée et a été laissée là pendant 30 secondes. Le volume de liquide absorbé a été mesuré avec un instrument électronique calibré. Six bandelettes GCF de chaque dent ont été placées directement dans un tube Eppendorf vide et conservées à -80°C jusqu'à l'analyse. Le jour de l'analyse, les bandelettes sont remises en suspension dans 480 µL de PBS dans un tube Eppendorf. L'échantillon a été secoué pendant une nuit à 600 tr/min à 4°C, puis centrifugé pendant 60 minutes à 4 000 tr/min à 4°C.

La plaque sous-gingivale a été collectée en insérant deux pointes de papier standardisées (n° 30) sur six sites (mésio-buccal, buccal, disto-buccal, mésio-palatin, palatin et distopalatin) par dent, à l'exception des 3èmes molaires. Deux pointes de papier ont été placées dans la poche et laissées en place pendant 10 secondes. Les pointes de papier de chaque dent par quadrant ont été placées directement dans un tube Falcon vide et conservées à -80°C jusqu'à l'analyse. Le jour de l'analyse, chaque échantillon de plaque a été obtenu en regroupant le matériel de plusieurs dents et en le remettant en suspension dans 50 μL de PBS par bandelette dans un tube Falcon. L'échantillon a été secoué pendant une nuit à 600 tr/min à 4°C, puis vortexé pendant 1 minute sur un vortexeur de paillasse et soniqué pendant 1 min. Il a ensuite été centrifugé pendant 60 minutes. à 4000 tr/min à 4°C. 1 ml du surnageant a été collecté pour une étape de centrifugation supplémentaire à 16 100 x g pendant 10 minutes à 4°C avant que les culots ne soient collectés pour une analyse plus approfondie.

Extraction et quantification de l'ADN : L'ADN a été extrait de 1 ml de salive, d'extraits de papier et de sérum à l'aide du kit d'ADN génomique bactérien GenElute conformément aux protocoles établis. Les concentrations des échantillons ont été quantifiées à l’aide d’un fluoromètre Qubit 4 et du kit de test Qubit™ dsDNA HS.

Préparation et séquençage des bibliothèques : des bibliothèques d'ADN ont été préparées pour le séquençage de nouvelle génération selon les protocoles établis. Le séquençage a été réalisé sur une plateforme Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Analyse bioinformatique du microbiote : cette procédure comprenait des évaluations de la diversité alpha, de la diversité bêta et de la taille de l'effet LDA dans l'analyse taxonomique.

Analyse protéomique : Des protéomiques quantitatives ont été réalisées selon les protocoles établis. Les peptides ont été séparés à l'aide d'un système Thermo Scientific EASY-nLC 1200 avec un émetteur de silice de 15 cm et 75 µm de diamètre rempli de résine ReproSil-Pur C18-AQ. L'identification des protéines a été réalisée à l'aide de Scaffold v4.0. Les données MS ont été recherchées avec Mascot dans une base de données personnalisée, qui comprenait la base de données Homo sapiens Uniprot, une base de données de contaminants MS de 260 séquences et des séquences inversées comme leurre. Les résultats de la recherche ont été importés dans Scaffold pour validation, avec des filtres définis sur un taux de fausses découvertes de protéines de 3,0 % avec un minimum de 2 peptides et un taux de fausses découvertes de peptides de 1,0 %.

Analyse fonctionnelle des protéines régulées et analyse statistique : Nous avons effectué une analyse d'enrichissement à l'aide du logiciel R et du package clusterProfiler. Les termes d'ontologie génétique ont été identifiés à partir de la base de données « Processus biologiques » et classés par signification statistique à l'aide d'une distribution hypergéométrique. La correction Benjamini-Hochberg a été appliquée, avec des seuils de signification fixés à une valeur p <0,01 et une valeur q <0,05.