Картирование микробиома и протеома при пародонтите

Исследуемая популяция: согласно данным Всемирного семинара 2017 года по классификации заболеваний и состояний пародонта и периимплантатов, в это исследование были включены 3 системно здоровых и некурящих пациента с пародонтитом III стадии и степени C. Клинические измерения пародонта включали глубину зондирования (PD), потерю клинического прикрепления (CAL), дихотомическую оценку кровотечения при зондировании (BOP +/-), десневой индекс (GI) и индекс зубного налета (PI). Все клинические параметры регистрировались в шести точках (мезио-щечная, буккальная, дисто-щечная, мезио-небная, небная и дисто-небная) на каждый зуб, за исключением 3-х моляров, одним исследователем (бакалавр А.) с использованием ручного пародонтального зонда. Процент рентгенологической потери костной массы (RBL) в интерпроксимальных участках рассчитывали на цифровых панорамных рентгенограммах как отношение расстояния между уровнем кости и цементно-эмалевым соединением к длине корня.

Отбор проб: Образцы слюны, сыворотки, десневой жидкости (GCF) и поддесневого налета были собраны через 1 день после клинических пародонтальных записей. Все образцы были получены утром с 8:30 до 10:30.

Сначала собирали все нестимулированные образцы слюны. Участникам было предложено воздержаться от еды, питья (кроме воды), жевания резинки, чистки зубов и использования зубной нити за 2 часа до сбора слюны. Затем их попросили дать слюне скапливаться на дне рта и позволить слюне пассивно стечь в трубку сокола в течение 5 минут, которую затем хранили непосредственно при -80°C. В день анализа 1 мл размороженной слюны центрифугировали при 4000 об/мин при 4°С в течение 20 минут.

Для получения образцов сыворотки из локтевой вены стандартным методом венепункции брали 5 мл венозной крови. Сыворотку выделяли центрифугированием при 1500 g в течение 15 минут при 4°С, а затем сразу же замораживали и хранили при -80°С.

GCF собирали с шести участков (мезио-щечной, дисто-щечной, мезио-небной, небной и дисто-небной) каждого зуба, за исключением третьих моляров, с помощью стерильных бумажных полосок. Бумажную полоску помещали внутрь кармана до появления легкого сопротивления и оставляли там на 30 секунд. Объем абсорбированной жидкости измеряли калиброванным электронным прибором. Шесть стрипов GCF от каждого зуба помещали непосредственно в пустую пробирку Эппендорфа и хранили при -80°C до анализа. В день анализа полоски ресуспендировали в 480 мкл PBS в пробирке Эппендорфа. Образец встряхивали в течение ночи при 600 об/мин при 4°С, затем центрифугировали в течение 60 минут при 4000 об/мин при 4°С.

Поддесневой налет собирали путем введения двух стандартизированных бумажных штифтов (№:30) в шести местах (мезио-щечном, дисто-щечном, мезио-небном, небном и дисто-небном) на каждый зуб, за исключением третьих моляров. Две бумажные штифты были помещены в карман и оставлены на 10 секунд. Бумажные штифты с каждого зуба в каждом квадранте помещали непосредственно в пустую пробирку Falcon и хранили при -80°C до анализа. В день анализа каждый образец налета получали путем объединения материала из нескольких зубов и ресуспендирования его в 50 мкл PBS на полоску в пробирке Falcon. Образец встряхивали в течение ночи при 600 об/мин при 4°C, затем перемешивали в течение 1 минуты на настольном вихревом устройстве и обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты. Затем центрифугировали в течение 60 мин. при 4000 об/мин при 4°С. 1 мл супернатанта собирали для дополнительного центрифугирования при 16 100 g в течение 10 минут при 4°C, прежде чем осадки собирали для дальнейшего анализа.

Экстракция ДНК и количественная оценка: ДНК экстрагировали из 1 мл слюны, экстрактов бумажных штифтов и сыворотки с использованием набора бактериальной геномной ДНК GenElute в соответствии с установленными протоколами. Концентрации образцов определяли количественно с использованием флуорометра Qubit 4 и набора для анализа Qubit™ dsDNA HS.

Подготовка библиотеки и секвенирование. Библиотеки ДНК были подготовлены для секвенирования следующего поколения в соответствии с установленными протоколами. Секвенирование проводили на платформе Illumina NovaSeq 6000 2x150b.

Биоинформатический анализ микробиоты: эта процедура включала оценку альфа-разнообразия, бета-разнообразия и величины эффекта LDA в таксономическом анализе.

Протеомный анализ: Количественный протеомный анализ проводили в соответствии с установленными протоколами. Пептиды разделяли с использованием системы Thermo Scientific EASY-nLC 1200 с кварцевым эмиттером диаметром 15 см и диаметром 75 мкм, заполненным смолой ReproSil-Pur C18-AQ. Идентификацию белков проводили с помощью Scaffold v4.0. Данные МС были проверены с помощью Mascot по индивидуальной базе данных, которая включала базу данных Uniprot Homo sapiens, базу данных примесей MS из 260 последовательностей и обратные последовательности в качестве приманки. Результаты поиска были импортированы в Scaffold для проверки, при этом фильтры были настроены на уровень ложного обнаружения белков 3,0% с минимум 2 пептидами и уровень ложного обнаружения пептидов 1,0%.

Функциональный анализ регулируемых белков и статистический анализ. Мы провели анализ обогащения с использованием программного обеспечения R и пакета ClusterProfiler. Термины генной онтологии были идентифицированы из базы данных «Биологический процесс» и ранжированы по статистической значимости с использованием гипергеометрического распределения. Была применена коррекция Бенджамини-Хохберга с порогами значимости, установленными на уровне p < 0,01 и q < 0,05.