ソケットの保存に使用される高密度ポリテトラフルオロエチレン膜上の歯科バイオフィルムのマイクロバイオーム分析 (MADBioS)

この研究はランダム化比較臨床試験として組織され、口腔外科の一般集団から患者を募集しました。 参加者は、従来の治療では影響を受けた歯を保存できないため、少なくとも1本の抜歯とその後のインプラント埋入の適応となります。 研究に参加する前に、すべての参加者は研究の詳細を確認した後、インフォームドコンセントを提供する必要があります。

最初にスクリーニングされた 56 人の参加者のうち、39 人の参加者が対象基準を満たし、Web ベースのランダム化ツール (https://www.randomizer.org/) を介して 2 つの研究グループのいずれかにランダムに割り当てられました。 両方のグループにおいて、参加者がランダムに割り当てられた後、50％の自家骨と50％のウシ異種移植片（cerabone®、botiss biomaterials GmbH、ドイツ、ツォッセン）からなる複合骨移植片を使用して、抜歯直後にソケット移植手術が行われます。以下のグループに：

• M1: グループ M1 では、移植部位は d-PTFE 膜 (Permamem®、botiss biomaterials GmbH、Zossen、ドイツ) で覆われ、
• M2: グループ M2 では、移植部位は代替 d-PTFE 膜 (Cytoplast™、Osteogenics Biomedical、テキサス州、米国) で覆われました。

以前の研究研究では、ソケットの保存がない場合、保存技術が適用された場合と比較して大幅に大きな体積損失につながることが実証されているため、この研究には非介入対照グループは含まれませんでした。

抜歯と掻爬後、頬骨壁の完全性が評価されます。 次に、ソケットの基部と中央部分は自家骨で充填され、残りの上部（頬壁のレベルまで）は牛骨生体材料と自家骨の 50:50 混合物で充填されます。 d-PTFE 膜は頬側および舌側の軟組織弁の下に配置され、骨壁上部の 3 ～ 5 mm をカバーします。 膜の中央部分は露出したままとなり、一次創傷閉鎖を達成しようとすることはありません。

このアプローチにより、頬側壁の保存の程度に基づいてカスタマイズされた膜被覆が可能になり、骨再生のサポートが最適化されます。 手術前に、参加者全員が機械による歯垢と歯石の除去を受け、口腔衛生の指導を受けました。 経口抗生物質クラボシン 1000 mg、Pliva、ザグレブ、クロアチア、またはクリンダマイシン MIP 600 mg、Chem. 薬局。 Fabrik GmbH（ドイツ、イングベルト）は、ペニシリンアレルギー患者に対して、手術の1時間前に投与します。 さらに、患者は術前に 0.2% ジグルコン酸クロルヘキシジン溶液 (Parodontax 0.2%、Brentford、London、UK) で洗い流されました。

2.4. 外科的プロトコールと膜抽出 術前評価に続いて、1:200,000 の濃度でアドレナリンを含む局所麻酔 4% アルチカイン塩酸塩 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Germany) が、抜歯が必要な領域と大臼歯後部の 2 つの領域に投与されました。自家骨採取用に選択された同じ顎四分円内の領域。 歯の非外傷性抜歯後、歯槽は完全に創面切除され、骨壁の完全性が歯周プローブ (15 UNC Color-Coded、Hu-Friedy、米国シカゴ) で評価されました。 隣接する歯の頬側表面の周囲の溝内切開に続いて、外科用キュレット (Lucas 2.5 mm、Helmut Zepf、ザイティンゲン オーバーフラハト、ドイツ) を使用して全層の粘膜骨膜弁を持ち上げました。 頬側骨壁と必要な自家移植片の量を徹底的に評価した後、ドナー部位で全層皮弁を持ち上げ、Safescraper® Twist 骨スクレーパー (Geistlich Bone Harvesting Instruments、バーゼル、スイス) を使用して自家骨を採取しました。 。 その後、標準的な縫合技術を使用してドナー部位を主な目的で閉じました。

移植は、ウシ異種移植片（cerabone®、Botiss Biomaterials GmbH、Zossen、ドイツ）と自家移植片の混合物を使用して行われました。 グループの割り当てに基づいて、d-PTFE メンブレンを使用して抽出ソケットをカバーしました。M1 グループの場合は permamem® (Botiss Biomaterials GmbH、ドイツ、ゾッセン)、M2 グループの場合は Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical、テキサス州、米国) のいずれかです。 皮弁を再配置し、再吸収性モノフィラメント 6.0 縫合糸 (SMI、ベルギー、St. Vith、Surgicryl Rapid 6.0) で固定し、膜の中央部分を意図的に露出させた。

抜歯から 4 週間後、両方のグループで d-PTFE 膜を除去し、治癒をサポートするために抜歯窩の頂端部分を覆う偽骨膜を露出させたままにしました。 その後、膜はさらなる実験室分析のために準備され、治癒が 6 か月間進行し、その後、準備された部位にインプラントの埋入が行われました。

d-PTFE 膜上の細菌の付着を評価するために、4 週間の治癒後の膜除去直後にサンプルを SEM 分析用に準備しました。 細菌懸濁液中で 4 時間インキュベートした後、膜を滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) ですすぎ、高流量滅菌チャンバー内で風乾しました。 次いで膜を、0.1 M PBS (pH 7.2)中の4%グルタルアルデヒドおよび0.5%パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich、バーリントン、バーモント州、米国)を含む溶液(Sigma-Aldrich、バーリントン、バーモント州、米国)を用いて4℃で固定した。 ）。 固定後、サンプルは、イメージングの準備として、エタノール濃度を増加させながら (50%、70%、80%、90%、100%) 浸漬する段階的な脱水プロセスを受けました。 次に、各膜を導電性カーボンテープを使用してサンプルホルダーに取り付けました。 表面の導電性を高め、電子ビームの高真空条件下での電子の帯電を防ぐために、精密エッチングおよびコーティング システム (PECS II、Gatan Inc.、プレザントン、カリフォルニア、米国) を使用して、金パラジウムの薄い 15 nm 層が適用されました。 ）。 最後に、SEM イメージングは​​、Jeol JSM-7800F 電界放射型走査電子顕微鏡 (日本電子株式会社、東京、日本) を使用して、7 kV の加速電圧および 10 mm の作動距離を使用して実行されました。 このアプローチにより、バイオフィルムの形態と膜表面上の細菌の分布を高解像度で視覚化することが可能になりました。

DNA 核酸の抽出 Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel、Duren、Germany) を使用し、改変された細菌プロトコールに従い、収集した膜超音波処理サンプルから DNA を単離しました。 1.5 mlエッペンドルフチューブ内の超音波処理サンプルを15,000 rpmで15分間遠心分離し、その後上清を除去して、約50μlの沈殿物を残した。 この沈殿物を、製造業者の修正細菌プロトコールの指定に従って、調製したG+溶解緩衝液250μlに再懸濁し、十分にボルテックスした。 次に、新たに調製したリゾチーム溶液 40 μl を加え、サンプルを 37℃ で 1 時間インキュベートしました。 この後、30μlのプロテ​​イナーゼKを添加し、サンプルを56℃で2時間インキュベートした。 インキュベーション後、400μlのB3緩衝液を添加し、サンプルをボルテックスし、次いで70℃で15分間再度インキュベートした。 400μlの冷却98%エタノールを添加することによりDNAを沈殿させた。 メーカーのプロトコルを次のステップで再開し、最終溶出量を BE 50 μl に減らしました。 抽出されたゲノム DNA の濃度と純度は、Qubit 蛍光光度計を使用して評価されました。

定量的リアルタイム PCR (qPCR) 分析膜超音波処理サンプル中の細菌の定量は、Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ、米国) 上の RT-PCR と特定の TaqMan アッセイを使用して実行されました。 (Applied Biosystems、米国カリフォルニア州フォスターシティ) 主要な細菌種をターゲットにしています。 これらのアッセイには、う蝕の発生に高リスクで寄与することで知られるグラム陽性の通性嫌気性菌ストレプトコッカス・ミュータンスおよびストレプトコッカス・ソブリヌス、およびこれらの種のアンタゴニストとして作用するストレプトコッカス・サリバリウスなど、う蝕原性の重要な細菌が含まれていた。 さらに、グラム陰性嫌気性菌である Veillonella parvula および Aggregatibacter actinomycetemcomitans を分析して、バイオフィルムの相互作用および歯肉および歯周感染症の進行との関連を調査しました。 16s rRNA 遺伝子に対する特異的な TaqMan アッセイを使用して、歯垢中の総細菌量を表しました。 TaqMan アッセイのプライマーとプローブは、各細菌の遺伝子を特異的に標的とするように設計されました。 全細菌の定量化のために、16s rRNA 遺伝子の保存領域が参照として選択されました。

RT-PCR 反応混合物 (20 μL) は、TaqMan Master Mix 10 μL、選択した細菌ごとに個別の Custom TaqMan アッセイ 1 μL、水 4 μL、および 0.5 ng/μL に希釈した DNA サンプル 5 μL で構成されていました。 各 TaqMan アッセイには、gtfB、gtfT、tnpA、lktA、および rpoB 遺伝子を増幅するための特定のカスタム設計プライマーと、参照コントロールとしての 16s rRNA 遺伝子が含まれていました。 さらに、各アッセイには、AM (フルオレセイン アミダイト) 色素と Q (クエンチャー) を備えたカスタム設計の TaqMan 蛍光標識プローブが含まれていました。 7500 Fast Real-Time PCR System での PCR 条件は次のとおりです。Taq DNA ポリメラーゼ活性化のために最初に 95℃ で 10 分間インキュベートし、続いて 95℃ 15 秒間 (DNA 変性) と 60℃ を 50 サイクル行いました。 Cで1分間（プライマーの結合と伸長）。 反応は、すべての遺伝子の非テンプレート対照と並行して、各細菌について 3 つずつ 96 ウェル プレートで実行されました。

各細菌種の増幅遺伝子および合計 16s rRNA の検出と定量は、TaqMan プローブの蛍光シグナルの変化に基づいて行われました。 標的核酸部位でのプローブのハイブリダイゼーションおよび加水分解時に蛍光が放出されるため、蛍光強度の増加は遺伝子増幅のレベルを示します。 結果は、検出に必要な蛍光レベルを表し、指数関数的増幅段階内で一貫して設定される閾値サイクル (Ct) 値を使用して測定されました。 標的遺伝子の十分な DNA が増幅されると、蛍光シグナルが検出され、Ct 値が検出が発生したサイクルを示します。 Ct 値が高いほど、サンプル中の標的遺伝子の初期濃度が低いことに対応し、Ct 値が低いほど、初期濃度が高いことを示します。

各細菌集団の相対定量は、標的細菌グループの Ct 値と総細菌量 (16s rRNA 相当) の Ct 値の差を表す ΔCt を使用して計算されました。

NGS 16S rRNA 遺伝子の可変領域 3 および 4 のアンプリコン配列決定を目的として、20 個の M1 膜と 16 個の M2 膜のサンプルから DNA が単離され、米国テキサス州の分子研究所 (MRDNA) に送られました。 アンプリコン配列決定では、プライマー 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') および 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') のセットを使用しました。 シーケンス データは、ペアエンドの逆多重化された fastq ファイルの形式で「Illumina の BaseSpace Sequence Hub」からダウンロードされました。 データ処理は、ソフトウェア パッケージ Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2) を使用して実行されました。 処理には、DADA2 プログラムを使用したフィルタリングとノイズ除去、配列の連結 (ペアエンド シーケンシングが使用されたため)、およびキメラの存在の可能性の制御が含まれます。 微生物の分類学的決定には、QIIME2 の Naive Bayes 分類ツールが適用され、SILVA データベース バージョン 138 で動作するように調整されました。 配列は、99% の類似性の基準に従ってグループ化されました。

すべてのサンプルの多様性と豊富さは、Pycharm 環境内の Python プログラミング言語バージョン 3.12 によって seaborn、matplotlib、pandas、および matplotlib ライブラリを使用して、アルファ多様性 (シャノン指数) とベータ多様性 (ブレイ-カーティスの相違度) によって推定されました。