Mikrobiomanalyse von Zahnbiofilm auf hochdichten Polytetrafluorethylen-Membranen, die bei der Alveolenkonservierung verwendet werden (MADBioS)

Diese Studie wurde als randomisierte kontrollierte klinische Studie organisiert, bei der Patienten aus einer allgemeinen Population von Oralchirurgie-Praxen rekrutiert wurden. Den Teilnehmern wird mindestens eine Zahnextraktion und anschließende Implantatinsertion angezeigt, da herkömmliche Therapien die betroffenen Zähne nicht erhalten. Vor der Teilnahme an der Studie müssen alle Teilnehmer nach Durchsicht der Studiendetails eine Einverständniserklärung abgeben.

Von den 56 ursprünglich gescreenten Teilnehmern erfüllten 39 Teilnehmer die Einschlusskriterien und wurden über ein webbasiertes Randomisierungstool (https://www.randomizer.org/) zufällig einer von zwei Studiengruppen zugeordnet. In beiden Gruppen wird unmittelbar nach der Zahnextraktion eine Alveolentransplantation unter Verwendung eines zusammengesetzten Knochentransplantats durchgeführt, das zu 50 % aus autogenem Knochen und zu 50 % aus bovinem Xenotransplantat besteht (Cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Deutschland), nachdem die Teilnehmer zufällig zugewiesen wurden an folgende Gruppen:

• M1: In der Gruppe M1 wurde die transplantierte Stelle mit einer d-PTFE-Membran (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Deutschland) abgedeckt
• M2: In der Gruppe M2 wurde die transplantierte Stelle mit einer alternativen d-PTFE-Membran (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA) abgedeckt.

In diese Studie wurde keine Kontrollgruppe ohne Intervention einbezogen, da frühere Forschungsstudien gezeigt haben, dass das Fehlen einer Schaftkonservierung zu einem deutlich größeren Volumenverlust führt als bei der Anwendung von Konservierungstechniken.

Nach der Zahnextraktion und Kürettage wird die Integrität der bukkalen Knochenwand beurteilt. Anschließend werden die Basis und der mittlere Teil der Pfanne mit autologem Knochen gefüllt, während der verbleibende obere Teil (bis zur Höhe der Wangenwand) mit einer 50:50-Mischung aus bovinem Knochenbiomaterial und autologem Knochen gefüllt wird. Eine d-PTFE-Membran wird unter den bukkalen und lingualen Weichteillappen positioniert und bedeckt 3–5 mm der oberen Knochenwand. Der zentrale Teil der Membran bleibt freigelegt, ohne dass versucht wird, einen primären Wundverschluss zu erreichen.

Dieser Ansatz ermöglicht eine maßgeschneiderte Membranabdeckung basierend auf dem Grad der Erhaltung der bukkalen Wand und optimiert so die Unterstützung der Knochenregeneration. Vor der Operation erhielten alle Teilnehmer eine mechanische Plaque- und Zahnsteinentfernung und wurden in Mundhygienepraktiken eingewiesen. Ein orales Antibiotikum: Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatien, oder Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Deutschland, für Penicillin-Allergiker, wird eine Stunde vor der Operation verabreicht. Zusätzlich wurden die Patienten präoperativ mit einer 0,2 %igen Chlorhexidindigluconatlösung (Parodontax 0,2 %, Brentford, London, UK) gespült.

2.4. Chirurgisches Protokoll und Membranextraktion Nach der präoperativen Beurteilung wurde eine Lokalanästhesie mit 4 % Articainhydrochlorid mit Adrenalin in einer Konzentration von 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Deutschland) in zwei Regionen verabreicht: dem für die Zahnextraktion vorgesehenen Bereich und dem retromolaren Bereich Region im selben Kieferquadranten, die für die autogene Knochenentnahme ausgewählt wurde. Nach der atraumatischen Extraktion des Zahns wurde die Alveole gründlich gereinigt und die Integrität der Knochenwände mit einer parodontalen Sonde (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA) beurteilt. Nach einem intrasulkulären Einschnitt um die bukkale Oberfläche der benachbarten Zähne wurde ein Mukoperiostlappen voller Dicke mit einer chirurgischen Kürette (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Deutschland) angehoben. Nach einer gründlichen Beurteilung der bukkalen Knochenwände und der erforderlichen Menge an Autotransplantat wurde an der Spenderstelle ein Lappen in voller Dicke angehoben und autogener Knochen mit dem Knochenschaber Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Schweiz) entnommen. . Die Entnahmestelle wurde anschließend mit Standard-Nahttechniken primär verschlossen.

Die Transplantation erfolgte mit der Mischung aus Rinder-Xenotransplantat (Cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Deutschland) und Autotransplantat. Basierend auf der Gruppenzuordnung wurde eine d-PTFE-Membran zur Abdeckung der Extraktionsalveole verwendet – entweder permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Deutschland) für die M1-Gruppe oder Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) für die M2-Gruppe. Der Lappen wurde neu positioniert und mit resorbierbaren Monofilament-6.0-Nähten (SMI, St. Vith, Belgien, Surgicryl Rapid 6.0) befestigt, wobei der zentrale Teil der Membran absichtlich freigelegt wurde.

Vier Wochen nach der Extraktion wurde die d-PTFE-Membran in beiden Gruppen entfernt, sodass das Pseudoperiost, das den krestalen Teil der Extraktionsalveole bedeckte, freigelegt blieb, um die Heilung zu unterstützen. Anschließend wurde die Membran für weitere Laboranalysen vorbereitet und die Heilung sechs Monate lang fortschreiten gelassen. Anschließend wurde an der vorbereiteten Stelle ein Implantat platziert.

Um die bakterielle Anhaftung an den d-PTFE-Membranen zu bewerten, wurden die Proben unmittelbar nach der Membranentfernung nach 4 Wochen Heilungszeit für die SEM-Analyse vorbereitet. Nach 4-stündiger Inkubation in Bakteriensuspensionen wurden die Membranen in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und anschließend in einer sterilen Kammer mit hohem Durchfluss luftgetrocknet. Anschließend wurden die Membranen bei 4 °C mit einer Lösung fixiert, die 4 % Glutaraldehyd und 0,5 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) in 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) enthielt ). Nach der Fixierung durchliefen die Proben einen abgestuften Dehydrierungsprozess durch Eintauchen in steigende Ethanolkonzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %), um sie für die Bildgebung vorzubereiten. Anschließend wurde jede Membran mit leitfähigem Kohlenstoffband auf einem Probenhalter befestigt. Um die Oberflächenleitfähigkeit zu verbessern und die Elektronenaufladung unter den Hochvakuumbedingungen des Elektronenstrahls zu verhindern, wurde eine dünne 15 nm dicke Gold-Palladium-Schicht mit dem Präzisionsätz- und Beschichtungssystem (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Kalifornien, USA) aufgetragen ). Abschließend wurde die SEM-Bildgebung mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokio, Japan) unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 7 kV und einem Arbeitsabstand von 10 mm durchgeführt. Dieser Ansatz ermöglichte eine hochauflösende Visualisierung der Biofilmmorphologie und der Bakterienverteilung auf den Membranoberflächen.

Extraktion von DNA-Nukleinsäuren DNA wurde aus gesammelten Membran-Ultraschallproben unter Verwendung des Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Düren, Deutschland) nach einem modifizierten Bakterienprotokoll isoliert. Beschallte Proben in 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt, wobei etwa 50 μl Sediment zurückblieben. Dieses Sediment wurde in 250 μl eines vorbereiteten G+-Lysepuffers, wie im modifizierten Bakterienprotokoll des Herstellers angegeben, resuspendiert und gründlich gevortext. Anschließend wurden 40 μl frisch zubereitete Lysozymlösung zugegeben und die Probe 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 30 μl Proteinase K zugegeben und die Probe 2 Stunden lang bei 56 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 400 μl B3-Puffer hinzugefügt, die Probe wurde gevortext und dann erneut 15 Minuten lang bei 70 °C inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 400 μl gekühltem 98 %igem Ethanol ausgefällt. Für die nachfolgenden Schritte wurde das Protokoll des Herstellers übernommen, wobei das endgültige Elutionsvolumen auf 50 μl BE reduziert wurde. Die Konzentration und Reinheit der extrahierten genomischen DNA wurden mit einem Qubit-Fluorometer bewertet.

Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (qPCR) Die Quantifizierung von Bakterien in den Membran-Ultraschallproben wurde mittels RT-PCR auf einem Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) mit spezifischen TaqMan-Assays durchgeführt (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) zielt auf wichtige Bakterienarten ab. Diese Tests umfassten Bakterien von kariogener Bedeutung, wie die grampositiven fakultativen Anaerobier Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus, die für ihren risikoreichen Beitrag zur Kariesentstehung bekannt sind, sowie Streptococcus salivarius, der als Antagonist dieser Arten fungiert. Darüber hinaus wurden die gramnegativen Anaerobier Veillonella parvula und Aggregatibacter actinomycetemcomitans analysiert, um Biofilm-Wechselwirkungen und Zusammenhänge mit dem Fortschreiten der Zahnfleisch- und Parodontalinfektion zu untersuchen. Ein spezifischer TaqMan-Assay für das 16s-rRNA-Gen wurde verwendet, um die gesamte Bakterienlast im Zahnbelag darzustellen. TaqMan-Assay-Primer und -Sonden wurden entwickelt, um gezielt auf die Gene jedes Bakteriums abzuzielen. Für die Gesamtquantifizierung der Bakterien wurde die konservierte Region des 16s-rRNA-Gens als Referenz ausgewählt.

Das RT-PCR-Reaktionsgemisch (20 µL) bestand aus 10 µL TaqMan Master Mix, 1 µL individueller benutzerdefinierter TaqMan-Assays für jedes ausgewählte Bakterium, 4 µL Wasser und 5 µL DNA-Probe, verdünnt auf 0,5 ng/µL. Jeder TaqMan-Assay enthielt speziell entwickelte Primer zur Amplifikation der Gene gtfB, gtfT, tnpA, lktA und rpoB sowie das 16s-rRNA-Gen als Referenzkontrolle. Darüber hinaus enthielt jeder Assay eine speziell entwickelte fluoreszierend markierte TaqMan-Sonde mit AM-Farbstoff (Fluoresceinamidit) und einem Q (Quencher). Die PCR-Bedingungen auf dem 7500 Fast Real-Time PCR System waren wie folgt: eine anfängliche Inkubation bei 95 °C für 10 Minuten zur Taq-DNA-Polymerase-Aktivierung, gefolgt von 50 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden (DNA-Denaturierung) und 60 °C C für 1 Minute (Primerbindung und -verlängerung). Die Reaktionen wurden in 96-Well-Platten mit Dreifachansätzen für jedes Bakterium sowie Nicht-Template-Kontrollen für alle Gene durchgeführt.

Der Nachweis und die Quantifizierung der amplifizierten Gene für jede Bakterienart und der gesamten 16s-rRNA basierten auf Veränderungen im Fluoreszenzsignal der TaqMan-Sonden. Bei der Hybridisierung und Hydrolyse der Sonde an der Zielnukleinsäurestelle wurde Fluoreszenz emittiert, sodass ein Anstieg der Fluoreszenzintensität den Grad der Genamplifikation anzeigte. Die Ergebnisse wurden anhand eines Schwellenwertzyklus (Ct) gemessen, der den für den Nachweis erforderlichen Fluoreszenzpegel darstellt und konsistent innerhalb der exponentiellen Amplifikationsphase festgelegt wird. Wenn genügend DNA des Zielgens amplifiziert ist, wird das Fluoreszenzsignal nachgewiesen, wobei der Ct-Wert den Zyklus angibt, in dem die Erkennung erfolgte. Ein höherer Ct-Wert entspricht einer niedrigeren Anfangskonzentration des Zielgens in der Probe, während ein niedrigerer Ct-Wert eine höhere Anfangskonzentration anzeigt.

Die relative Quantifizierung jeder Bakterienpopulation wurde mithilfe von ΔCt berechnet, der die Differenz zwischen dem Ct-Wert für die Zielbakteriengruppe und dem Ct-Wert für die gesamte Bakterienlast (16s-rRNA-Äquivalent) darstellt.

NGS Zum Zweck der Amplikonsequenzierung der variablen Regionen 3 und 4 des 16S-rRNA-Gens wurde DNA aus den Proben von 20 M1- und 16 M2-Membranen isoliert und an das Molecular Research Laboratory (MRDNA) in Texas, USA, geschickt. Für die Amplikonsequenzierung wurde ein Satz von Primern 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') und 806R (5'-GGACTACNNGGGTATTCTAAT-3') verwendet. Die Sequenzierungsdaten wurden von „Illumina’s BaseSpace Sequence Hub“ in Form von gepaarten, demultiplexten Fastq-Dateien heruntergeladen. Die Datenverarbeitung erfolgte mit dem Softwarepaket Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Die Verarbeitung umfasste das Filtern und Entrauschen mit dem DADA2-Programm, die Verkettung von Sequenzen (da Pair-End-Sequenzierung verwendet wurde) sowie die Kontrolle auf das Vorhandensein möglicher Chimären. Für die taxonomische Bestimmung von Mikroorganismen wurde das Naive Bayes-Klassifizierungstool in QIIME2 verwendet, angepasst an die Arbeit mit der SILVA-Datenbank, Version 138. Die Sequenzen wurden nach dem Kriterium einer Ähnlichkeit von 99 % gruppiert.

Die Diversität und der Reichtum aller Stichproben wurden anhand der Alpha-Diversität (Shannon-Index) und Beta-Diversität (Bray-Curtis-Unähnlichkeit) unter Verwendung der Bibliotheken Seaborn, Matplotlib, Pandas und Matplotlib mit der Programmiersprache Python, Version 3.12, in der Pycharm-Umgebung geschätzt.