Mikrobiomanalyse av dental biofilm på polytetrafluoretylenmembraner med høy tetthet som brukes til bevaring av sokkel (MADBioS)

Denne studien ble organisert som en randomisert kontrollert klinisk studie, som rekrutterte pasienter fra en generell populasjon ved oral kirurgi. Deltakerne er indisert for minst én tannekstraksjon og påfølgende implantatplassering på grunn av svikt i konvensjonelle terapier for å bevare berørte tenner. Før de går inn i studien, må alle deltakere gi informert samtykke etter å ha gjennomgått studiedetaljene.

Av 56 deltakere som først ble screenet, oppfylte 39 deltakere inklusjonskriteriene og ble tilfeldig fordelt til en av to studiegrupper via et nettbasert randomiseringsverktøy (https://www.randomizer.org/). I begge gruppene vil en socket-grafting-prosedyre utføres umiddelbart etter tannekstraksjon, ved bruk av et sammensatt beintransplantat bestående av 50 % autogent bein og 50 % bovin xenograft (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland), etter at deltakerne ble tilfeldig tildelt til følgende grupper:

• M1: I gruppen M1 ble det podede stedet dekket med en d-PTFE-membran (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland), og
• M2: I gruppen M2 ble det podede stedet dekket med en alternativ d-PTFE-membran (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Ingen ikke-intervensjonskontrollgruppe ble inkludert i denne studien, da tidligere forskningsstudier har vist at fravær av sokkelkonservering fører til betydelig større volumtap sammenlignet med når konserveringsteknikker brukes.

Etter tannekstraksjon og curettage vil integriteten til den bukkale beinveggen bli vurdert. Deretter vil basen og den sentrale delen av socket fylles med autologt bein, mens den resterende øvre delen (opp til nivået av bukkalveggen) vil fylles med en 50:50 blanding av bovint beinbiomateriale og autologt bein. En d-PTFE-membran vil bli plassert under de bukkale og linguale bløtvevsklaffene, som dekker 3-5 mm av den øvre benveggen. Den sentrale delen av membranen vil forbli eksponert, uten noe forsøk på å oppnå primær sårlukking.

Denne tilnærmingen gir mulighet for skreddersydd membrandekning basert på graden av bevaring av bukkal vegg, og optimaliserer støtte for beinregenerering. Før operasjonen fikk alle deltakerne mekanisk fjerning av plakk og tannstein og ble instruert i munnhygienepraksis. Et oralt antibiotikum Klavocin bud 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatia, eller Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Tyskland, for penicillin-allergiske pasienter, vil bli administrert en time før operasjonen. I tillegg ble pasientene skylt med en 0,2 % klorheksidindiglukonatløsning (Parodontax 0,2 %, Brentford, London, Storbritannia) preoperativt.

2.4. Kirurgisk protokoll og membranekstraksjon Etter den preoperative vurderingen ble lokalbedøvelse 4 % articainhydroklorid med adrenalin i en konsentrasjon på 1:200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Tyskland) administrert til to regioner: området indisert for tannekstraksjon og retromolar region i samme kjevekvadrant, valgt for autogen beinhøsting. Etter atraumatisk uttrekking av tannen ble socket grundig debridert, og integriteten til beinveggene ble vurdert med en periodontal probe (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Etter et intrasulkulært snitt rundt den bukkale overflaten av de tilstøtende tennene, ble en mucoperiosteal flik i full tykkelse hevet ved bruk av en kirurgisk curette (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Tyskland). Etter en grundig vurdering av de bukkale beinveggene og den nødvendige mengden autograft, ble en klaff i full tykkelse hevet på donorstedet, og autogent bein ble høstet med Safescraper® Twist beinskraper (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Sveits) . Donorstedet ble deretter lukket med primær intensjon ved bruk av standard suturteknikker.

Podningen ble utført med blandingen av bovin xenograft (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) og autograft. Basert på gruppeoppdrag ble en d-PTFE-membran brukt til å dekke ekstraksjonshylsen - enten permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) for M1-gruppen eller Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) for M2-gruppen. Klaffen ble reposisjonert og festet med resorberbare monofilament 6.0-suturer (SMI, St. Vith, Belgia, Surgicryl Rapid 6.0), slik at den sentrale delen av membranen ble eksponert med hensikt.

Fire uker etter ekstraksjon ble d-PTFE-membranen fjernet i begge gruppene, og etterlot pseudoperiosteum som dekket crestal-delen av ekstraksjonshylsen utsatt for å støtte helbredelse. Membranen ble deretter klargjort for videre laboratorieanalyse, og tilheling fikk fortsette i seks måneder, hvoretter implantatplassering ble utført på det forberedte stedet.

For å evaluere bakteriell adherens på d-PTFE-membranene, ble prøver klargjort for SEM-analyse umiddelbart etter membranfjerning etter 4 ukers tilheling. Etter inkubering i bakteriesuspensjoner i 4 timer, ble membranene skylt i sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter lufttørket i et sterilt kammer med høy strømning. Membraner ble deretter fiksert ved 4°C med en løsning som inneholdt 4 % glutar-aldehyd og 0,5 % paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) i 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) ). Etter fiksering gjennomgikk prøvene en gradert dehydreringsprosess ved nedsenking i økende etanolkonsentrasjoner (50 %, 70 %, 80 %, 90 % og 100 %) for å forberede for bildebehandling. Hver membran ble deretter montert på en prøveholder ved bruk av ledende karbontape. For å forbedre overflatens ledningsevne og forhindre elektronladning under høyvakuumforholdene til elektronstrålen, ble et tynt 15 nm lag av gull-palladium påført ved bruk av presisjonsetsing og beleggingssystemet (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, California, USA ). Til slutt ble SEM-avbildning utført med et Jeol JSM-7800F feltemisjonsskannende elektronmikroskop (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), ved bruk av en akselererende spenning på 7 kV og en arbeidsavstand på 10 mm. Denne tilnærmingen tillot høyoppløselig visualisering av biofilmmorfologi og bakteriefordeling på membranoverflatene.

Ekstraksjon av DNA-nukleinsyrer DNA ble isolert fra innsamlede membransonikatprøver ved bruk av Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Tyskland) etter en modifisert bakteriell protokoll. Sonikerte prøver i 1,5 ml Eppendorf-rør ble sentrifugert ved 15 000 rpm i 15 minutter, hvoretter supernatanten ble fjernet, og etterlot omtrent 50 μl sediment. Dette sedimentet ble resuspendert i 250 μl av en klargjort G+ lyseringsbuffer, som spesifisert av produsentens modifiserte bakterieprotokoll, og vortexet grundig. Deretter ble 40 μl nylaget lysozymløsning tilsatt, og prøven ble inkubert ved 37°C i 1 time. Etter dette ble 30 μl proteinase K tilsatt, og prøven ble inkubert ved 56°C i 2 timer. Etter inkubering ble 400 μl B3-buffer tilsatt, prøven ble vortexet, og deretter inkubert igjen ved 70°C i 15 minutter. DNA ble presipitert ved å tilsette 400 μl avkjølt 98 % etanol. Produsentens protokoll ble gjenopptatt for påfølgende trinn, med det endelige elueringsvolumet redusert til 50 μl BE. Konsentrasjonen og renheten til det ekstraherte genomiske DNA ble vurdert ved bruk av et Qubit fluorometer.

Kvantitativ sanntids-PCR (qPCR)-analyse Kvantifisering av bakterier i membransonikatprøvene ble utført ved bruk av RT-PCR på et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, California, USA), med spesifikke TaqMan-analyser (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) rettet mot sentrale bakteriearter. Disse analysene inkluderte bakterier av kariogen betydning, slik som de gram-positive fakultative anaerobe Streptococcus mutans og Streptococcus sobrinus, kjent for deres høyrisikobidrag til kariesutvikling, og Streptococcus salivarius, som fungerer som en antagonist til disse artene. I tillegg ble de gram-negative anaerobe Veillonella parvula og Aggregatibacter actinomycetemcomitans analysert for å utforske biofilminteraksjoner og assosiasjoner med gingival og periodontal infeksjonsprogresjon. En spesifikk TaqMan-analyse for 16s rRNA-genet ble brukt for å representere den totale bakteriemengden i tannplakk. TaqMan-analyseprimere og -prober ble designet for å spesifikt målrette mot genene for hver bakterie. For total bakteriell kvantifisering ble den konserverte regionen til 16s rRNA-genet valgt som referanse.

RT-PCR-reaksjonsblandingen (20 µL) besto av 10 µL TaqMan Master Mix, 1 µL individuelle Custom TaqMan-analyser for hver utvalgt bakterie, 4 µL vann og 5 µL DNA-prøve fortynnet til 0,5 ng/µL. Hver TaqMan-analyse inneholdt spesifikke spesialdesignede primere for amplifisering av gtfB-, gtfT-, tnpA-, lktA- og rpoB-genene, samt 16s rRNA-genet som en referansekontroll. I tillegg inkluderte hver analyse en spesialdesignet TaqMan fluorescerende merket probe med AM (fluoresceinamiditt) fargestoff og en Q (quencher). PCR-betingelsene på 7500 Fast Real-Time PCR-systemet var som følger: en innledende inkubasjon ved 95°C i 10 minutter for Taq DNA-polymeraseaktivering, etterfulgt av 50 sykluser med 95°C i 15 sekunder (DNA-denaturering) og 60° C i 1 minutt (primerbinding og forlengelse). Reaksjonene ble utført i 96-brønners plater med triplikater for hver bakterie, sammen med ikke-malkontroller for alle gener.

Deteksjon og kvantifisering av de amplifiserte genene for hver bakterieart og totalt 16s rRNA var basert på endringer i fluorescenssignalet til TaqMan-probene. Fluorescens ble sendt ut ved hybridisering og hydrolyse av proben på målnukleinsyresetet, så en økning i fluorescensintensitet indikerte nivået av genamplifikasjon. Resultatene ble målt ved å bruke en terskelsyklus (Ct) verdi, som representerer fluorescensnivået som er nødvendig for deteksjon og er konsekvent satt innenfor den eksponentielle amplifikasjonsfasen. Ettersom tilstrekkelig DNA fra målgenet er amplifisert, detekteres det fluorescerende signalet, med Ct-verdien som indikerer syklusen der deteksjonen skjedde. En høyere Ct-verdi tilsvarer en lavere initialkonsentrasjon av målgenet i prøven, mens en lavere Ct-verdi indikerer en høyere initialkonsentrasjon.

Relativ kvantifisering av hver bakteriepopulasjon ble beregnet ved å bruke ΔCt, som representerer forskjellen mellom Ct-verdien for målbakteriegruppen og Ct-verdien for den totale bakteriemengden (16s rRNA-ekvivalent).

NGS For formålet med amplikonsekvensering av variable regioner 3 og 4 av 16S rRNA-genet, ble DNA isolert fra prøvene på 20 M1 og 16 M2 membraner og sendt til Molecular Research Laboratory (MRDNA) i Texas, USA. Amplikonsekvensering brukte et sett med primere 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') og 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Sekvenseringsdata ble lastet ned fra "Illuminas BaseSpace Sequence Hub" i form av parede, demultipleksede fastq-filer. Databehandling ble utført ved hjelp av programvarepakken Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Behandling inkluderte filtrering og denoising ved bruk av DADA2-programmet, sammenkobling av sekvenser (siden par-ende-sekvensering ble brukt), samt kontroll for tilstedeværelsen av mulige kimærer. For taksonomisk bestemmelse av mikroorganismer ble Naive Bayes-klassifiseringsverktøyet i QIIME2 brukt, tilpasset for å fungere med SILVA-databasen, versjon 138. Sekvensene ble gruppert i henhold til kriteriet 99% likhet.

Mangfoldet og rikdommen til alle prøvene ble estimert av alfa-diversitet (Shannon-indeks) og beta-diversitet (Bray-Curtis-forskjellighet) ved bruk av seaborn, matplotlib, pandaer og matplotlib-bibliotekene av Python-programmeringsspråket, versjon 3.12, i Pycharm-miljøet.