Mikrobiomanalyse af dental biofilm på polytetrafluorethylenmembraner med høj densitet, der bruges til konservering af sokkel (MADBioS)

Denne undersøgelse blev organiseret som et randomiseret kontrolleret klinisk forsøg, der rekrutterede patienter fra en generel population af oral kirurgi kontor. Deltageren er indiceret til mindst én tandudtrækning og efterfølgende implantatplacering på grund af, at konventionelle terapier ikke kan bevare de berørte tænder. Før de går ind i undersøgelsen, skal alle deltagere give informeret samtykke efter gennemgang af undersøgelsesdetaljerne.

Ud af 56 deltagere, der oprindeligt blev screenet, opfyldte 39 deltagere inklusionskriterierne og blev tilfældigt fordelt til en af ​​to undersøgelsesgrupper via et webbaseret randomiseringsværktøj (https://www.randomizer.org/). I begge grupper vil en socket-transplantationsprocedure blive udført umiddelbart efter tandekstraktion ved hjælp af et sammensat knogletransplantat bestående af 50 % autogent knogle og 50 % bovin xenograft (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland), efter at deltagerne er blevet tilfældigt tildelt til følgende grupper:

• M1: I gruppen M1 var det podede sted dækket med en d-PTFE-membran (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) og
• M2: I gruppen M2 var det podede sted dækket med en alternativ d-PTFE-membran (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Ingen non-intervention kontrolgruppe blev inkluderet i denne undersøgelse, da tidligere forskningsundersøgelser har vist, at fraværet af fatningskonservering fører til signifikant større volumentab sammenlignet med, når konserveringsteknikker anvendes.

Efter tandudtrækning og curettage vil integriteten af ​​den bukkale knoglevæg blive vurderet. Derefter vil bunden og den centrale del af soklen blive fyldt med autolog knogle, mens den resterende øvre del (op til niveauet af den bukkale væg) vil blive fyldt med en 50:50 blanding af bovint knoglebiomateriale og autolog knogle. En d-PTFE-membran vil blive placeret under de bukkale og linguale bløddelsflapper, der dækker 3-5 mm af den øvre knoglevæg. Den centrale del af membranen vil forblive blotlagt uden forsøg på at opnå primær sårlukning.

Denne tilgang giver mulighed for skræddersyet membrandækning baseret på graden af ​​mundvægsbevarelse, hvilket optimerer støtten til knogleregenerering. Før operationen modtog alle deltagere mekanisk plak- og tandstensfjernelse og blev instrueret i mundhygiejnepraksis. Et oralt antibiotikum Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatien eller Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Tyskland, til penicillin-allergiske patienter, vil blive administreret en time før operationen. Derudover skyllede patienterne med en 0,2 % klorhexidindigluconatopløsning (Parodontax 0,2 %, Brentford, London, UK) præoperativt.

2.4. Kirurgisk protokol og membranekstraktion Efter den præoperative vurdering blev lokalbedøvelse 4 % articainhydrochlorid med adrenalin i en koncentration på 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Tyskland) administreret til to regioner: området indiceret til tandudtrækning og retromolar region i samme kæbekvadrant, udvalgt til autogen knoglehøst. Efter atraumatisk ekstraktion af tanden blev soklen grundigt debrideret, og integriteten af ​​knoglevæggene blev vurderet med en parodontal probe (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Efter et intrasulkulært snit omkring den bukkale overflade af de tilstødende tænder blev en mucoperiosteal flap i fuld tykkelse hævet ved anvendelse af en kirurgisk curette (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Tyskland). Efter en grundig vurdering af de bukkale knoglevægge og den nødvendige mængde autograft, blev en flap i fuld tykkelse hævet på donorstedet, og autogen knogle blev høstet ved hjælp af Safescraper® Twist knogleskraberen (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Schweiz) . Donorstedet blev efterfølgende lukket med primær hensigt ved anvendelse af standard suturteknikker.

Podningen blev udført med blandingen af ​​bovin xenograft (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) og autograft. Baseret på gruppeopgave blev en d-PTFE-membran brugt til at dække ekstraktionsfatningen - enten permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Tyskland) til M1-gruppen eller Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) til M2-gruppen. Klappen blev genplaceret og fastgjort med resorberbare monofilament 6.0 suturer (SMI, St. Vith, Belgien, Surgicryl Rapid 6.0), hvilket efterlod den centrale del af membranen bevidst blotlagt.

Fire uger efter ekstraktion blev d-PTFE-membranen fjernet i begge grupper, hvilket efterlod pseudoperiosteum, der dækkede crestaldelen af ​​ekstraktionsskålen, udsat for at understøtte heling. Membranen blev derefter klargjort til yderligere laboratorieanalyse, og helingen fik lov til at skride frem i seks måneder, hvorefter implantatplacering blev udført på det forberedte sted.

For at evaluere bakteriel adhærens på d-PTFE-membranerne blev prøver forberedt til SEM-analyse umiddelbart efter membranfjernelse efter 4 ugers heling. Efter inkubation i bakteriesuspensioner i 4 timer blev membranerne skyllet i sterilt phosphatpufret saltvand (PBS) og derefter lufttørret i et højstrøms sterilt kammer. Membraner blev derefter fikseret ved 4°C med en opløsning indeholdende 4 % glutar-aldehyd og 0,5 % paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) i 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) ). Efter fiksering gennemgik prøverne en graderet dehydreringsproces ved nedsænkning i stigende ethanolkoncentrationer (50 %, 70 %, 80 %, 90 % og 100 %) for at forberede til billeddannelse. Hver membran blev derefter monteret på en prøveholder under anvendelse af ledende carbontape. For at forbedre overfladens ledningsevne og forhindre elektronopladning under elektronstrålens højvakuumforhold blev et tyndt 15 nm lag af guld-palladium påført ved hjælp af præcisionsætsnings- og belægningssystemet (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Californien, USA) ). Til sidst blev SEM-billeddannelse udført med et Jeol JSM-7800F feltemissionsscanningselektronmikroskop (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), ved brug af en accelerationsspænding på 7 kV og en arbejdsafstand på 10 mm. Denne tilgang tillod højopløsningsvisualisering af biofilmmorfologi og bakteriel fordeling på membranoverfladerne.

Ekstraktion af DNA-nukleinsyrer DNA blev isoleret fra indsamlede membransonikatprøver ved anvendelse af Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Tyskland) efter en modificeret bakteriel protokol. Sonikerede prøver i 1,5 ml Eppendorf-rør blev centrifugeret ved 15.000 rpm i 15 minutter, hvorefter supernatanten blev fjernet, hvilket efterlod ca. 50 μl sediment. Dette sediment blev resuspenderet i 250 μl af en forberedt G+ lysisbuffer, som specificeret af producentens modificerede bakterieprotokol, og vortexet grundigt. Derefter blev 40 μl frisklavet lysozymopløsning tilsat, og prøven blev inkuberet ved 37°C i 1 time. Herefter blev 30 μl proteinase K tilsat, og prøven blev inkuberet ved 56°C i 2 timer. Efter inkubation blev 400 μl B3 buffer tilsat, prøven blev vortexet og derefter inkuberet igen ved 70°C i 15 minutter. DNA blev præcipiteret ved at tilsætte 400 μl afkølet 98% ethanol. Producentens protokol blev genoptaget for efterfølgende trin, med det endelige elueringsvolumen reduceret til 50 μl BE. Koncentrationen og renheden af ​​det ekstraherede genomiske DNA blev vurderet ved anvendelse af et Qubit fluorometer.

Kvantitativ realtids-PCR-analyse (qPCR) Kvantificering af bakterier i membran-sonicatprøverne blev udført ved hjælp af RT-PCR på et Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) med specifikke TaqMan-assays (Applied Biosystems, Foster City, Californien, USA) rettet mod nøglebakteriearter. Disse assays inkluderede bakterier af kariogen betydning, såsom de gram-positive fakultative anaerober Streptococcus mutans og Streptococcus sobrinus, kendt for deres højrisikobidrag til cariesudvikling, og Streptococcus salivarius, der fungerer som en antagonist til disse arter. Derudover blev de gram-negative anaerobe Veillonella parvula og Aggregatibacter actinomycetemcomitans analyseret for at udforske biofilm-interaktioner og associationer med tandkøds- og periodontal infektionsprogression. Et specifikt TaqMan-assay for 16s rRNA-genet blev brugt til at repræsentere den samlede bakteriemængde i tandplak. TaqMan-analyseprimere og -prober blev designet til specifikt at målrette generne for hver bakterie. Til total bakteriel kvantificering blev den konserverede region af 16s rRNA-genet valgt som reference.

RT-PCR-reaktionsblandingen (20 µL) bestod af 10 µL TaqMan Master Mix, 1 µL individuelle Custom TaqMan-assays for hver udvalgt bakterie, 4 µL vand og 5 µL DNA-prøve fortyndet til 0,5 ng/µL. Hvert TaqMan-assay indeholdt specifikke specialdesignede primere til amplifikation af gtfB-, gtfT-, tnpA-, lktA- og rpoB-generne samt 16s rRNA-genet som referencekontrol. Derudover inkluderede hvert assay en specialdesignet TaqMan fluorescensmærket probe med AM (fluoresceinamidit) farvestof og en Q (quencher). PCR-betingelserne på 7500 Fast Real-Time PCR-systemet var som følger: en indledende inkubation ved 95°C i 10 minutter for Taq DNA-polymeraseaktivering, efterfulgt af 50 cyklusser af 95°C i 15 sekunder (DNA-denaturering) og 60° C i 1 minut (primerbinding og forlængelse). Reaktionerne blev udført i plader med 96 brønde med triplikater for hver bakterie, sammen med ikke-skabelonkontroller for alle gener.

Påvisning og kvantificering af de amplificerede gener for hver bakterieart og det totale 16s rRNA var baseret på ændringer i fluorescenssignalet fra TaqMan-proberne. Fluorescens blev udsendt ved hybridisering og hydrolyse af proben på målnukleinsyrestedet, så en stigning i fluorescensintensitet indikerede niveauet af genamplifikation. Resultaterne blev målt ved hjælp af en tærskelcyklus (Ct) værdi, som repræsenterer det fluorescensniveau, der er nødvendigt for detektion, og er konsekvent indstillet inden for den eksponentielle amplifikationsfase. Efterhånden som tilstrækkeligt DNA fra målgenet amplificeres, detekteres det fluorescerende signal, hvor Ct-værdien angiver den cyklus, hvori detektionen fandt sted. En højere Ct-værdi svarer til en lavere initialkoncentration af målgenet i prøven, mens en lavere Ct-værdi indikerer en højere initialkoncentration.

Relativ kvantificering af hver bakteriepopulation blev beregnet ved hjælp af ΔCt, der repræsenterer forskellen mellem Ct-værdien for målbakteriegruppen og Ct-værdien for den totale bakteriemængde (16s rRNA-ækvivalent).

NGS Med henblik på amplikonsekventering af variable regioner 3 og 4 af 16S rRNA-genet blev DNA isoleret fra prøverne på 20 M1 og 16 M2 membraner og sendt til Molecular Research Laboratory (MRDNA) i Texas, USA. Amplikonsekventering anvendte et sæt primere 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') og 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Sekventeringsdata blev downloadet fra "Illuminas BaseSpace Sequence Hub" i form af parrede, demultipleksede fastq-filer. Databehandling blev udført ved hjælp af softwarepakken Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Behandling omfattede filtrering og denoising ved hjælp af DADA2-programmet, sammenkædning af sekvenser (da par-ende-sekventering blev brugt) samt kontrol for tilstedeværelsen af ​​mulige kimærer. Til den taksonomiske bestemmelse af mikroorganismer blev Naive Bayes-klassificeringsværktøjet i QIIME2 anvendt, tilpasset til at arbejde med SILVA-databasen, version 138. Sekvenserne blev grupperet efter kriteriet 99% lighed.

Diversiteten og rigdommen af ​​alle prøver blev estimeret af alfa-diversitet (Shannon-indeks) og beta-diversitet (Bray-Curtis-forskellighed) ved brug af seaborn-, matplotlib-, pandas- og matplotlib-bibliotekerne af Python-programmeringssproget, version 3.12, i Pycharm-miljøet.