소켓 보존에 사용되는 고밀도 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인의 치과 생물막에 대한 미생물군집 분석 (MADBioS)

본 연구는 구강외과 진료실의 일반 인구 집단에서 환자를 모집하는 무작위 대조 임상 시험으로 구성되었습니다. 참가자는 영향을 받은 치아를 보존하기 위한 기존 치료법의 실패로 인해 적어도 한 번의 치아 추출 및 후속 임플란트 식립이 필요합니다. 연구에 참여하기 전에 모든 참가자는 연구 세부 사항을 검토한 후 사전 동의를 제공해야 합니다.

초기에 선별된 56명의 참가자 중 39명의 참가자가 포함 기준을 충족했으며 웹 기반 무작위 도구(https://www.randomizer.org/)를 통해 두 연구 그룹 중 하나에 무작위로 할당되었습니다. 두 그룹 모두 참가자를 무작위로 배정한 후 치아 추출 직후 50% 자가골과 50% 소 이종 이식편(cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Germany)으로 구성된 복합 뼈 이식편을 사용하여 소켓 이식 절차를 수행합니다. 다음 그룹에:

• M1: M1 그룹에서는 이식 부위를 d-PTFE 멤브레인(Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Germany)으로 덮었으며,
• M2: M2 그룹에서는 이식 부위를 대체 d-PTFE 멤브레인(Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA)으로 덮었습니다.

이전 연구 연구에서 소켓 보존이 없으면 보존 기술을 적용한 경우에 비해 훨씬 더 큰 볼륨 손실이 발생하는 것으로 나타났기 때문에 이 연구에는 개입하지 않은 대조군이 포함되지 않았습니다.

치아 추출 및 소파술 후 협측 뼈벽의 무결성이 평가됩니다. 그 다음, 소켓의 베이스와 중앙 부분은 자가골로 채워지고, 나머지 윗부분(협측벽 수준까지)은 소뼈 생체재료와 자가골의 50:50 혼합물로 채워집니다. d-PTFE 멤브레인은 협측 및 설측 연조직 플랩 아래에 위치하여 상부 뼈벽의 3~5mm를 덮습니다. 일차적인 상처 봉합을 시도하지 않고 막의 중앙 부분이 노출된 상태로 유지됩니다.

이 접근법은 협측 벽 보존 정도에 따라 맞춤형 멤브레인 적용을 가능하게 하여 뼈 재생을 위한 지원을 최적화합니다. 수술 전에 모든 참가자는 기계적 플라크 및 치석 제거를 받았으며 구강 위생 관행에 대해 교육을 받았습니다. 경구 항생제 Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, 크로아티아 또는 Clindamycin MIP 600 mg, Chem. 제약 페니실린 알레르기 환자를 위한 Fabrik GmbH(독일 Ingbert)는 수술 1시간 전에 투여됩니다. 또한 환자는 수술 전에 0.2% 클로르헥시딘 디글루코네이트 용액(Parodontax 0.2%, Brentford, London, UK)으로 헹구었습니다.

2.4. 수술 프로토콜 및 막 추출 수술 전 평가 후, 1:200,000 농도의 아드레날린과 함께 국소 마취된 4% 염산 염산(Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Germany)을 발치 부위와 후구치 두 부위에 투여했습니다. 자가 뼈 채취를 위해 선택된 동일한 턱 사분면의 영역입니다. 치아의 비외상적 발치 후, 소켓을 완전히 제거하고 치주 프로브(15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA)를 사용하여 뼈벽의 무결성을 평가했습니다. 인접한 치아의 협측 표면 주변의 섬도 내 절개 후 수술용 큐렛(Lucas 2.5mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Germany)을 사용하여 전체 두께의 점막 골막 피판을 들어올렸습니다. 협측 뼈 벽과 필요한 자가 이식 수량을 철저히 평가한 후, 기증자 부위에서 전체 두께 플랩을 올리고 Safescraper® Twist 뼈 스크레이퍼(Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Switzerland)를 사용하여 자가 뼈를 채취했습니다. . 표준 봉합 기술을 사용하여 기증자 부위를 일차적으로 폐쇄했습니다.

접목은 소 이종 이식편(cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, 독일 Zossen 소재)과 자가 이식편의 혼합물을 사용하여 수행되었습니다. 그룹 할당에 따라 d-PTFE 멤브레인을 발치와를 덮는 데 사용했습니다. M1 그룹의 경우 permamem®(Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Germany) 또는 M2 그룹의 경우 Cytoplast™(Osteogenics Biomedical, Texas, USA) 중 하나를 사용했습니다. 플랩을 재배치하고 흡수성 모노필라멘트 6.0 봉합사(SMI, 벨기에 St. Vith, Surgicryl Rapid 6.0)로 고정하여 막의 중앙 부분을 의도적으로 노출시켰습니다.

발치 4주 후, 두 그룹 모두에서 d-PTFE 막을 제거하여 발치와의 치조 부분을 덮고 있는 가성골막을 노출시켜 치유를 지원했습니다. 그 후 추가 실험실 분석을 위해 멤브레인을 준비하고 6개월 동안 치유가 진행되도록 한 후 준비된 부위에 임플란트 식립을 수행했습니다.

d-PTFE 멤브레인의 박테리아 부착을 평가하기 위해, 4주간의 치유 후 멤브레인 제거 직후 SEM 분석을 위해 샘플을 준비했습니다. 박테리아 현탁액에서 4시간 동안 배양한 후, 막을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹구고 고유량 멸균 챔버에서 공기 건조했습니다. 그런 다음 막을 0.1M PBS(pH 7.2)(Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA)에 4% 글루타르-알데히드와 0.5% 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA)를 함유한 용액을 사용하여 4°C에서 고정했습니다. ). 고정 후, 샘플은 이미징을 준비하기 위해 증가하는 에탄올 농도(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%)에 담가서 단계적 탈수 과정을 거쳤습니다. 그런 다음 각 멤브레인을 전도성 탄소 테이프를 사용하여 샘플 홀더에 장착했습니다. 전자빔의 고진공 조건에서 표면 전도성을 향상시키고 전자 대전을 방지하기 위해 정밀 에칭 및 코팅 시스템(PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, California, USA)을 사용하여 얇은 15nm 금-팔라듐 층을 적용했습니다. ). 마지막으로 Jeol JSM-7800F 전계 방출 주사 전자 현미경 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하여 가속 전압 7 kV 및 작동 거리 10 mm를 사용하여 SEM 이미징을 수행했습니다. 이 접근법을 통해 생물막 형태와 막 표면의 박테리아 분포를 고해상도로 시각화할 수 있었습니다.

DNA 핵산 추출 변형된 박테리아 프로토콜에 따라 Nucleospin Tissue Kit(Macherey Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 수집된 막 초음파 처리 샘플로부터 DNA를 분리했습니다. 1.5ml Eppendorf 튜브에 담긴 초음파 처리된 샘플을 15분 동안 15,000rpm에서 원심분리한 후 상층액을 제거하여 약 50μl의 침전물을 남겼습니다. 이 침전물을 제조업체의 수정된 박테리아 프로토콜에 따라 지정된 대로 준비된 G+ 용해 완충액 250μl에 재현탁하고 완전히 와류시켰습니다. 다음으로, 새로 제조된 리소자임 용액 40 μl를 첨가하고 샘플을 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 그 후, 30 μl의 단백질분해효소 K를 첨가하고 샘플을 56°C에서 2시간 동안 배양했습니다. 배양 후 B3 완충액 400μl를 첨가하고 시료를 vortexing한 후 다시 70°C에서 15분간 배양하였다. 냉각된 98% 에탄올 400μl를 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 제조업체의 프로토콜은 후속 단계에서 재개되었으며 최종 용출량은 BE 50μl로 감소되었습니다. 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도는 Qubit 형광계를 사용하여 평가되었습니다.

정량적 실시간 PCR(qPCR) 분석 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)에서 특정 TaqMan 분석을 사용하여 RT-PCR을 사용하여 막 초음파 처리 샘플 내 박테리아의 정량화를 수행했습니다. (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) 주요 박테리아 종을 표적으로 삼았습니다. 이러한 분석에는 우식 발생에 대한 고위험 기여로 알려진 그람 양성 조건 혐기성 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)와 이들 종에 대한 길항제 역할을 하는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)와 같은 우식 유발 중요성이 있는 박테리아가 포함되었습니다. 또한, 그람 음성 혐기성 Veillonella parvula 및 Aggregatibacter actinomycetemcomitans를 분석하여 생물막 상호 작용 및 치은 및 치주 감염 진행과의 연관성을 조사했습니다. 16s rRNA 유전자에 대한 특정 TaqMan 분석을 사용하여 치태의 총 박테리아 부하를 나타냈습니다. TaqMan 분석 프라이머 및 프로브는 각 박테리아의 유전자를 구체적으로 표적으로 삼도록 설계되었습니다. 전체 박테리아 정량화를 위해 16s rRNA 유전자의 보존된 영역을 기준으로 선택했습니다.

RT-PCR 반응 혼합물(20μL)은 TaqMan Master Mix 10μL, 선택된 각 박테리아에 대한 개별 맞춤형 TaqMan 어세이 1μL, 물 4μL, 0.5ng/μL로 희석된 DNA 샘플 5μL로 구성되었습니다. 각 TaqMan 어세이에는 gtfB, gtfT, tnpA, lktA 및 rpoB 유전자와 참조 대조군인 16s rRNA 유전자를 증폭하기 위한 특정 맞춤형 설계 프라이머가 포함되어 있습니다. 또한 각 분석에는 AM(플루오레세인 아미다이트) 염료와 Q(소광제)가 포함된 맞춤형 TaqMan 형광 표지 프로브가 포함되었습니다. 7500 Fast Real-Time PCR 시스템의 PCR 조건은 다음과 같습니다: Taq DNA 중합효소 활성화를 위해 95°C에서 10분간 초기 배양한 후 95°C에서 15초 동안(DNA 변성) 50주기, 60°C에서 60°C에서 10분간 배양했습니다. C에서 1분 동안(프라이머 결합 및 확장). 반응은 모든 유전자에 대한 비주형 대조군과 함께 각 박테리아에 대해 3회 반복되는 96웰 플레이트에서 수행되었습니다.

각 박테리아 종에 대한 증폭된 유전자와 전체 16s rRNA의 검출 및 정량화는 TaqMan 프로브의 형광 신호 변화를 기반으로 했습니다. 표적 핵산 부위에서 프로브의 혼성화 및 가수분해 시 형광이 방출되므로 형광 강도의 증가는 유전자 증폭 수준을 나타냅니다. 결과는 검출에 필요한 형광 수준을 나타내고 지수 증폭 단계 내에서 일관되게 설정되는 임계값 주기(Ct) 값을 사용하여 측정되었습니다. 목적 유전자의 DNA가 충분히 증폭되면 형광 신호가 검출되며, Ct 값은 검출이 발생한 주기를 나타냅니다. Ct 값이 높을수록 샘플 내 표적 유전자의 초기 농도가 낮음을 의미하고, Ct 값이 낮을수록 초기 농도가 높음을 나타냅니다.

각 박테리아 집단의 상대적 정량화는 표적 박테리아 그룹에 대한 Ct 값과 총 박테리아 로드(16s rRNA 등가)에 대한 Ct 값 간의 차이를 나타내는 ΔCt를 사용하여 계산되었습니다.

NGS 16S rRNA 유전자의 가변 영역 3과 4의 앰플리콘 서열 분석을 위해 20 M1 및 16 M2 막의 샘플에서 DNA를 분리하여 미국 텍사스에 있는 분자 연구소(MRDNA)로 보냈습니다. 앰플리콘 서열분석에서는 프라이머 341F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') 및 806R(5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') 세트를 사용했습니다. 시퀀싱 데이터는 쌍방향 역다중화 fastq 파일 형태로 "Illumina의 BaseSpace Sequence Hub"에서 다운로드되었습니다. 데이터 처리는 Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2(QIIME2) 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었습니다. 처리에는 DADA2 프로그램을 사용한 필터링 및 잡음 제거, 시퀀스 연결(페어 엔드 시퀀싱이 사용되었기 때문에) 및 가능한 키메라의 존재에 대한 제어가 포함되었습니다. 미생물의 분류학적 결정을 위해 QIIME2의 Naive Bayes 분류 도구가 적용되었으며 SILVA 데이터베이스 버전 138과 함께 작동하도록 조정되었습니다. 서열은 99% 유사성 기준에 따라 그룹화되었습니다.

모든 샘플의 다양성과 풍부함은 Pycharm 환경 내에서 Python 프로그래밍 언어 버전 3.12를 통해 seaborn, matplotlib, pandas 및 matplotlib 라이브러리를 사용하여 알파 다양성(Shannon 지수) 및 베타 다양성(Bray-Curtis 비평사성)으로 추정되었습니다.