Análisis del microbioma de la biopelícula dental sobre membranas de politetrafluoroetileno de alta densidad utilizadas en la preservación del alvéolo (MADBioS)

Este estudio se organizó como un ensayo clínico controlado aleatorio, que reclutó pacientes de una población general de un consultorio de cirugía bucal. Los participantes están indicados para al menos una extracción dental y posterior colocación de implantes debido al fracaso de las terapias convencionales para preservar los dientes afectados. Antes de ingresar al estudio, todos los participantes deben dar su consentimiento informado después de revisar los detalles del estudio.

De los 56 participantes evaluados inicialmente, 39 cumplieron los criterios de inclusión y fueron asignados aleatoriamente a uno de los dos grupos de estudio mediante una herramienta de aleatorización basada en la web (https://www.randomizer.org/). En ambos grupos, se realizará un procedimiento de injerto de alvéolo inmediatamente después de la extracción del diente, utilizando un injerto óseo compuesto que comprende 50% de hueso autógeno y 50% de xenoinjerto bovino (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Alemania), después de que los participantes fueron asignados al azar a los siguientes grupos:

• M1: En el grupo M1, el sitio injertado se cubrió con una membrana de d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Alemania) y
• M2: En el grupo M2, el sitio del injerto se cubrió con una membrana alternativa de d-PTFE (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, EE. UU.).

En este estudio no se incluyó ningún grupo de control sin intervención, ya que estudios de investigación anteriores han demostrado que la ausencia de preservación del alvéolo conduce a una pérdida de volumen significativamente mayor en comparación con cuando se aplican técnicas de preservación.

Después de la extracción y el legrado del diente, se evaluará la integridad de la pared ósea bucal. Luego, la base y la porción central del alvéolo se llenarán con hueso autólogo, mientras que la porción superior restante (hasta el nivel de la pared bucal) se llenará con una mezcla 50:50 de biomaterial óseo bovino y hueso autólogo. Se colocará una membrana de d-PTFE debajo de los colgajos de tejido blando vestibular y lingual, cubriendo entre 3 y 5 mm de la pared ósea superior. La porción central de la membrana permanecerá expuesta, sin que se intente lograr el cierre primario de la herida.

Este enfoque permite una cobertura de membrana personalizada según el grado de preservación de la pared bucal, optimizando el soporte para la regeneración ósea. Antes de la cirugía, todos los participantes recibieron eliminación mecánica de placa y cálculo y fueron instruidos en prácticas de higiene bucal. Un antibiótico oral Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Croacia, o Clindamicina MIP 600 mg, Chem. Farmacéutica. Fabrik GmbH, Ingbert, Alemania, para pacientes alérgicos a la penicilina, se administrará una hora antes de la cirugía. Además, los pacientes se enjuagaron con una solución de digluconato de clorhexidina al 0,2 % (Parodontax 0,2 %, Brentford, Londres, Reino Unido) antes de la operación.

2.4. Protocolo quirúrgico y extracción de membranas Tras la evaluación preoperatoria, se administró anestesia local clorhidrato de articaína al 4% con adrenalina a una concentración de 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Alemania) en dos regiones: la zona indicada para la extracción dental y la zona retromolar. región en el mismo cuadrante de la mandíbula, seleccionada para la recolección de hueso autógeno. Después de la extracción atraumática del diente, se desbridó completamente el alvéolo y se evaluó la integridad de las paredes óseas con una sonda periodontal (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, EE. UU.). Después de una incisión intrasulcular alrededor de la superficie bucal de los dientes adyacentes, se elevó un colgajo mucoperióstico de espesor total utilizando una cureta quirúrgica (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Alemania). Después de una evaluación exhaustiva de las paredes óseas bucales y la cantidad requerida de autoinjerto, se elevó un colgajo de espesor total en el sitio donante y se extrajo hueso autógeno utilizando el raspador óseo Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basilea, Suiza). . Posteriormente se cerró la zona donante por primera intención utilizando técnicas de sutura estándar.

El injerto se realizó con la mezcla de xenoinjerto bovino (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Alemania) y autoinjerto. Según la asignación de grupo, se utilizó una membrana de d-PTFE para cubrir el alvéolo de extracción, ya sea permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Alemania) para el grupo M1 o Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, EE. UU.) para el grupo M2. El colgajo se reposicionó y se aseguró con suturas monofilamento reabsorbibles 6.0 (SMI, St. Vith, Bélgica, Surgicryl Rapid 6.0), dejando la parte central de la membrana expuesta intencionalmente.

Cuatro semanas después de la extracción, se retiró la membrana d-PTFE en ambos grupos, dejando expuesto el pseudoperiostio que cubría la parte crestal del alvéolo de extracción para favorecer la curación. Luego se preparó la membrana para análisis de laboratorio adicionales y se dejó que la curación progresara durante seis meses, después de lo cual se realizó la colocación del implante en el sitio preparado.

Para evaluar la adherencia bacteriana en las membranas de d-PTFE, se prepararon muestras para el análisis SEM inmediatamente después de retirar la membrana después de 4 semanas de curación. Después de la incubación en suspensiones bacterianas durante 4 horas, las membranas se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril y luego se secaron al aire en una cámara estéril de alto flujo. Luego se fijaron las membranas a 4 °C con una solución que contenía glutaraldehído al 4 % y paraformaldehído al 0,5 % (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, EE. UU.) en PBS 0,1 M (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, EE. UU. ). Después de la fijación, las muestras se sometieron a un proceso de deshidratación gradual mediante inmersión en concentraciones crecientes de etanol (50 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 %) para prepararlas para la obtención de imágenes. Luego, cada membrana se montó en un soporte de muestra utilizando cinta de carbono conductora. Para mejorar la conductividad de la superficie y evitar la carga de electrones en las condiciones de alto vacío del haz de electrones, se aplicó una fina capa de oro-paladio de 15 nm utilizando el sistema de recubrimiento y grabado de precisión (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, California, EE. UU. ). Finalmente, las imágenes SEM se realizaron con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokio, Japón), utilizando un voltaje de aceleración de 7 kV y una distancia de trabajo de 10 mm. Este enfoque permitió la visualización de alta resolución de la morfología de la biopelícula y la distribución bacteriana en las superficies de las membranas.

Extracción de ácidos nucleicos de ADN Se aisló ADN de muestras recogidas mediante ultrasonidos de membrana utilizando el kit Nucleospin Tissue (Macherey Nagel, Duren, Alemania) siguiendo un protocolo bacteriano modificado. Las muestras sonicadas en tubos Eppendorf de 1,5 ml se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos, después de lo cual se eliminó el sobrenadante, dejando aproximadamente 50 μl de sedimento. Este sedimento se resuspendió en 250 µl de un tampón de lisis G+ preparado, según lo especificado en el protocolo bacteriano modificado del fabricante, y se agitó completamente. A continuación, se añadieron 40 µl de solución de lisozima recién preparada y la muestra se incubó a 37°C durante 1 hora. A continuación, se añadieron 30 µl de proteinasa K y la muestra se incubó a 56°C durante 2 horas. Después de la incubación, se agregaron 400 µl de tampón B3, la muestra se agitó y luego se incubó nuevamente a 70 °C durante 15 minutos. El ADN se precipitó añadiendo 400 µl de etanol al 98% enfriado. El protocolo del fabricante se reanudó para los pasos posteriores, con el volumen de elución final reducido a 50 µl de BE. La concentración y pureza del ADN genómico extraído se evaluaron utilizando un fluorómetro Qubit.

Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qPCR) La cuantificación de bacterias en las muestras de sonicación de membrana se realizó mediante RT-PCR en un sistema de PCR en tiempo real rápido Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.), con ensayos TaqMan específicos. (Applied Biosystems, Foster City, California, EE. UU.) dirigido a especies bacterianas clave. Estos ensayos incluyeron bacterias de importancia cariogénica, como los anaerobios facultativos grampositivos Streptococcus mutans y Streptococcus sobrinus, conocidos por su contribución de alto riesgo al desarrollo de caries, y Streptococcus salivarius, que actúa como antagonista de estas especies. Además, se analizaron los anaerobios gramnegativos Veillonella parvula y Aggregatibacter actinomycetemcomitans para explorar las interacciones de la biopelícula y las asociaciones con la progresión de la infección gingival y periodontal. Se utilizó un ensayo TaqMan específico para el gen 16s rRNA para representar la carga bacteriana total en la placa dental. Los cebadores y sondas del ensayo TaqMan se diseñaron para apuntar específicamente a los genes de cada bacteria. Para la cuantificación bacteriana total, se seleccionó como referencia la región conservada del gen 16s rRNA.

La mezcla de reacción de RT-PCR (20 µL) constaba de 10 µL de TaqMan Master Mix, 1 µL de ensayos TaqMan personalizados individuales para cada bacteria seleccionada, 4 µL de agua y 5 µL de muestra de ADN diluida a 0,5 ng/µL. Cada ensayo TaqMan contenía cebadores específicos diseñados a medida para amplificar los genes gtfB, gtfT, tnpA, lktA y rpoB, así como el gen 16s rRNA como control de referencia. Además, cada ensayo incluyó una sonda TaqMan marcada con fluorescencia de diseño personalizado con colorante AM (amidita de fluoresceína) y un Q (apagador). Las condiciones de PCR en el sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast fueron las siguientes: una incubación inicial a 95 °C durante 10 minutos para la activación de la ADN polimerasa Taq, seguida de 50 ciclos de 95 °C durante 15 segundos (desnaturalización del ADN) y 60 °C. C durante 1 minuto (unión de imprimación y extensión). Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos con triplicados para cada bacteria, junto con controles sin plantilla para todos los genes.

La detección y cuantificación de los genes amplificados para cada especie bacteriana y el rRNA 16s total se basaron en cambios en la señal de fluorescencia de las sondas TaqMan. Se emitió fluorescencia tras la hibridación e hidrólisis de la sonda en el sitio del ácido nucleico diana, por lo que un aumento en la intensidad de la fluorescencia indicó el nivel de amplificación del gen. Los resultados se midieron utilizando un valor de ciclo umbral (Ct), que representa el nivel de fluorescencia necesario para la detección y se establece consistentemente dentro de la fase de amplificación exponencial. A medida que se amplifica suficiente ADN del gen diana, se detecta la señal fluorescente, indicando el valor Ct el ciclo en el que se produjo la detección. Un valor de Ct más alto corresponde a una concentración inicial más baja del gen diana en la muestra, mientras que un valor de Ct más bajo indica una concentración inicial más alta.

La cuantificación relativa de cada población bacteriana se calculó utilizando ΔCt, que representa la diferencia entre el valor de Ct para el grupo bacteriano objetivo y el valor de Ct para la carga bacteriana total (equivalente a ARNr 16s).

NGS Con el fin de secuenciar amplicones de las regiones variables 3 y 4 del gen 16S rRNA, se aisló ADN de las muestras de 20 membranas M1 y 16 M2 y se envió al Laboratorio de Investigación Molecular (MRDNA) en Texas, EE. UU. La secuenciación de amplicones utilizó un conjunto de cebadores 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') y 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Los datos de secuenciación se descargaron del "BaseSpace Sequence Hub de Illumina" en forma de archivos fastq demultiplexados de extremos emparejados. El procesamiento de datos se realizó utilizando el paquete de software Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). El procesamiento incluyó filtrado y eliminación de ruido mediante el programa DADA2, concatenación de secuencias (ya que se utilizó secuenciación por pares), así como el control de la presencia de posibles quimeras. Para la determinación taxonómica de microorganismos se aplicó la herramienta clasificadora Naive Bayes en QIIME2, adaptada para trabajar con la base de datos SILVA, versión 138. Las secuencias se agruparon según el criterio del 99% de similitud.

La diversidad y riqueza de todas las muestras se estimaron mediante diversidad alfa (índice de Shannon) y diversidad beta (disimilaridad de Bray-Curtis) utilizando las bibliotecas seaborn, matplotlib, pandas y matplotlib mediante el lenguaje de programación Python, versión 3.12, dentro del entorno Pycharm.