Микробиомный анализ зубной биопленки на мембранах из политетрафторэтилена высокой плотности, используемых для консервации лунок (MADBioS)

Это исследование было организовано как рандомизированное контролируемое клиническое исследование с набором пациентов из общей популяции хирургического отделения челюстно-лицевой хирургии. Участнику показано как минимум одно удаление зуба и последующая установка имплантата из-за неспособности традиционных методов лечения сохранить пораженные зубы. Прежде чем принять участие в исследовании, все участники должны предоставить информированное согласие после ознакомления с деталями исследования.

Из 56 участников, прошедших первоначальный скрининг, 39 участников соответствовали критериям включения и были случайным образом распределены в одну из двух исследовательских групп с помощью веб-инструмента рандомизации (https://www.randomizer.org/). В обеих группах процедура трансплантации лунки будет выполнена сразу после удаления зуба с использованием композитного костного трансплантата, содержащего 50% аутогенной кости и 50% бычьего ксенотрансплантата (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Цоссен, Германия), после того как участники были рандомизированы. следующим группам:

• М1: В группе М1 место трансплантации было покрыто мембраной из d-ПТФЭ (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Цоссен, Германия) и
• М2: В группе М2 место трансплантации было покрыто альтернативной мембраной из d-ПТФЭ (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Техас, США).

В это исследование не была включена контрольная группа без вмешательства, поскольку предыдущие исследования показали, что отсутствие консервации лунки приводит к значительно большей потере объема по сравнению с тем, когда применяются методы консервации.

После удаления зуба и выскабливания будет оценена целостность щечной костной стенки. Затем основание и центральная часть лунки будут заполнены аутологичной костью, а оставшаяся верхняя часть (до уровня щечной стенки) будет заполнена смесью 50:50 биоматериала бычьей кости и аутологичной кости. Мембрана из d-PTFE будет расположена под щечным и язычным лоскутами мягких тканей, закрывая 3-5 мм верхней костной стенки. Центральная часть мембраны останется открытой, без каких-либо попыток добиться первичного закрытия раны.

Этот подход позволяет адаптировать покрытие мембраны в зависимости от степени сохранности щечной стенки, оптимизируя поддержку регенерации кости. Перед операцией все участники прошли механическое удаление зубного налета и камней и были проинструктированы о правилах гигиены полости рта. Пероральный антибиотик Клавоцин 2 раза в день 1000 мг, Плива, Загреб, Хорватия, или Клиндамицин MIP 600 мг, Chem. Фарм. Fabrik GmbH, Ингберт, Германия, пациентам с аллергией на пенициллин вводят за час до операции. Дополнительно перед операцией пациенты промывали 0,2% раствором диглюконата хлоргексидина (Parodontax 0,2%, Брентфорд, Лондон, Великобритания).

2.4. Хирургический протокол и экстракция мембраны. После предоперационной оценки была проведена местная анестезия 4% артикаина гидрохлоридом с адреналином в концентрации 1:200 000 (Убистезин Форте, 3М, Нойс, Германия) в двух областях: области, указанной для удаления зуба, и ретромолярной области. область в том же квадранте челюсти, выбранная для забора аутогенной кости. После атравматического удаления зуба лунку тщательно обработали и целостность костных стенок оценивали с помощью пародонтального зонда (15 UNC с цветовой кодировкой, Hu-Friedy, Чикаго, США). После внутризубчатого разреза вокруг щечной поверхности соседних зубов с помощью хирургической кюретки (Lucas 2,5 мм, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Германия) поднимали слизисто-надкостничный лоскут на всю толщину. После тщательной оценки стенок щечной кости и определения необходимого количества аутотрансплантата на донорском участке поднимали полнослойный лоскут и собирали аутогенную кость с помощью костного скребка Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Базель, Швейцария). . Донорский участок впоследствии был закрыт первичным натяжением с использованием стандартной техники наложения швов.

Прививку осуществляли смесью бычьего ксенотрансплантата (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Цоссен, Германия) и аутотрансплантата. В зависимости от группового распределения для покрытия лунки для экстракции использовалась мембрана из d-PTFE - либо permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Цоссен, Германия) для группы M1, либо Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Техас, США) для группы M2. Лоскут был перемещен и закреплен рассасывающимися мононитями 6.0 (SMI, St. Vith, Бельгия, Surgicryl Rapid 6.0), оставляя центральную часть мембраны намеренно открытой.

Через четыре недели после удаления мембрану d-PTFE удалили в обеих группах, оставив псевдонадкостницу, покрывающую крестальную часть лунки экстракции, открытой для поддержки заживления. Затем мембрану подготовили для дальнейшего лабораторного анализа, и заживление продолжалось в течение шести месяцев, после чего на подготовленное место была произведена установка имплантата.

Чтобы оценить адгезию бактерий к мембранам из d-PTFE, образцы были подготовлены для анализа SEM сразу после удаления мембраны после 4 недель заживления. После инкубации в бактериальных суспензиях в течение 4 часов мембраны промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем сушили на воздухе в стерильной камере с высоким потоком. Затем мембраны фиксировали при 4°C раствором, содержащим 4 % глутар-альдегида и 0,5 % параформальдегида (Sigma-Aldrich, Берлингтон, Вермонт, США) в 0,1 М PBS (рН 7,2) (Sigma-Aldrich, Берлингтон, Вермонт, США). ). После фиксации образцы подвергались постепенному процессу обезвоживания путем погружения в этанол возрастающей концентрации (50%, 70%, 80%, 90% и 100%) для подготовки к визуализации. Затем каждую мембрану устанавливали на держатель образца с помощью проводящей углеродной ленты. Чтобы повысить проводимость поверхности и предотвратить зарядку электронов в условиях высокого вакуума электронного луча, с помощью системы прецизионного травления и покрытия (PECS II, Gatan Inc., Плезантон, Калифорния, США) был нанесен тонкий слой золота-палладия толщиной 15 нм. ). Наконец, изображение СЭМ было проведено с помощью сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Токио, Япония) с использованием ускоряющего напряжения 7 кВ и рабочего расстояния 10 мм. Этот подход позволил визуализировать с высоким разрешением морфологию биопленки и распределение бактерий на поверхности мембран.

Экстракция ДНК-нуклеиновых кислот ДНК выделяли из собранных образцов мембранного ультразвука с использованием набора Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Germany) в соответствии с модифицированным бактериальным протоколом. Обработанные ультразвуком образцы в пробирках Эппендорфа объемом 1,5 мл центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 минут, после чего супернатант удаляли, оставляя примерно 50 мкл осадка. Этот осадок ресуспендировали в 250 мкл приготовленного буфера для лизиса G+, как указано в модифицированном бактериальном протоколе производителя, и тщательно встряхивали. Далее добавляли 40 мкл свежеприготовленного раствора лизоцима и инкубировали образец при 37°С в течение 1 часа. После этого добавляли 30 мкл протеиназы К и образец инкубировали при 56°С в течение 2 часов. После инкубации добавляли 400 мкл буфера B3, образец перемешивали на встряхивании, а затем снова инкубировали при 70°C в течение 15 минут. ДНК осаждали добавлением 400 мкл охлажденного 98% этанола. Протокол производителя возобновлялся для последующих этапов, при этом конечный объем элюирования уменьшался до 50 мкл BE. Концентрацию и чистоту выделенной геномной ДНК оценивали с помощью флуорометра Qubit.

Количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR) Количественный анализ бактерий в образцах мембранного ультразвуката проводился с использованием RT-PCR на системе быстрой ПЦР в реальном времени Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) со специальными анализами TaqMan. (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), нацеленная на ключевые виды бактерий. Эти анализы включали бактерии, имеющие кариесогенное значение, такие как грамположительные факультативные анаэробы Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus, известные своим высоким риском развития кариеса, а также Streptococcus salivarius, который действует как антагонист этих видов. Кроме того, были проанализированы грамотрицательные анаэробы Veillonella parvula и Aggregatibacter actinomycetemcomitans для изучения взаимодействия биопленок и их связи с прогрессированием инфекций десен и пародонта. Для определения общей бактериальной нагрузки в зубном налете использовался специальный анализ TaqMan для гена 16s рРНК. Праймеры и зонды для анализа TaqMan были разработаны специально для воздействия на гены каждой бактерии. Для количественного определения общего количества бактерий в качестве эталона была выбрана консервативная область гена 16s рРНК.

Реакционная смесь RT-PCR (20 мкл) состояла из 10 мкл TaqMan Master Mix, 1 мкл индивидуальных тестов TaqMan для каждой выбранной бактерии, 4 мкл воды и 5 мкл образца ДНК, разбавленного до 0,5 нг/мкл. Каждый анализ TaqMan содержал специально разработанные праймеры для амплификации генов gtfB, gtfT, tnpA, lktA и rpoB, а также ген 16s рРНК в качестве эталонного контроля. Кроме того, каждый анализ включал специально разработанный флуоресцентно-меченный зонд TaqMan красителем AM (флуоресцеинамидит) и Q (тушитель). Условия ПЦР на системе 7500 Fast Real-Time PCR System были следующими: начальная инкубация при 95°C в течение 10 минут для активации ДНК-полимеразы Taq, затем 50 циклов при 95°C по 15 секунд (денатурация ДНК) и 60°C. C в течение 1 минуты (связывание и удлинение праймера). Реакции проводили в 96-луночных планшетах в трех экземплярах для каждой бактерии, наряду с нематричным контролем для всех генов.

Обнаружение и количественная оценка амплифицированных генов для каждого вида бактерий и общей 16s рРНК были основаны на изменениях сигнала флуоресценции зондов TaqMan. Флуоресценция излучалась при гибридизации и гидролизе зонда в участке нуклеиновой кислоты-мишени, поэтому увеличение интенсивности флуоресценции указывало на уровень амплификации гена. Результаты измерялись с использованием значения порогового цикла (Ct), которое представляет собой уровень флуоресценции, необходимый для обнаружения, и последовательно устанавливается в фазе экспоненциальной амплификации. Когда достаточное количество ДНК целевого гена амплифицируется, флуоресцентный сигнал обнаруживается, при этом значение Ct указывает цикл, в котором произошло обнаружение. Более высокое значение Ct соответствует более низкой начальной концентрации целевого гена в образце, а более низкое значение Ct указывает на более высокую начальную концентрацию.

Относительную количественную оценку каждой бактериальной популяции рассчитывали с использованием ΔCt, представляющего разницу между значением Ct для целевой бактериальной группы и значением Ct для общей бактериальной нагрузки (эквивалент 16s рРНК).

NGS. Для секвенирования ампликонов вариабельных участков 3 и 4 гена 16S рРНК ДНК была выделена из образцов мембран 20 М1 и 16 М2 и отправлена ​​в Лабораторию молекулярных исследований (MRDNA) в Техасе, США. Для секвенирования ампликонов использовали набор праймеров 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') и 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Данные секвенирования были загружены из «Illumina's BaseSpace Sequence Hub» в виде парных демультиплексированных файлов fastq. Обработку данных проводили с использованием пакета программ Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Обработка включала фильтрацию и шумоподавление с помощью программы DADA2, конкатенацию последовательностей (поскольку использовалось парное секвенирование), а также контроль на наличие возможных химер. Для таксономического определения микроорганизмов был применен инструмент классификатора Naive Bayes в QIIME2, адаптированный для работы с базой данных SILVA версии 138. Последовательности были сгруппированы по критерию сходства 99%.

Разнообразие и богатство всех образцов оценивались по альфа-разнообразию (индекс Шеннона) и бета-разнообразию (несходство Брея-Кертиса) с использованием библиотек seaborn, matplotlib, pandas и matplotlib языка программирования Python версии 3.12 в среде Pycharm.