Analyse du microbiome du biofilm dentaire sur les membranes de polytétrafluoroéthylène haute densité utilisées dans la préservation des alvéoles (MADBioS)

Cette étude a été organisée sous la forme d'un essai clinique contrôlé randomisé, recrutant des patients parmi une population générale de cabinets de chirurgie buccale. Les participants sont indiqués pour au moins une extraction dentaire et la pose ultérieure d'un implant en raison de l'échec des thérapies conventionnelles à préserver les dents affectées. Avant de participer à l'étude, tous les participants doivent donner leur consentement éclairé après avoir examiné les détails de l'étude.

Sur les 56 participants initialement sélectionnés, 39 répondaient aux critères d'inclusion et ont été répartis au hasard dans l'un des deux groupes d'étude via un outil de randomisation en ligne (https://www.randomizer.org/). Dans les deux groupes, une procédure de greffe d'alvéole sera réalisée immédiatement après l'extraction dentaire, à l'aide d'une greffe osseuse composite comprenant 50 % d'os autogène et 50 % de xénogreffe bovine (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Allemagne), après que les participants aient été répartis au hasard. aux groupes suivants :

• M1 : Dans le groupe M1, le site greffé était recouvert d'une membrane d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Allemagne), et
• M2 : Dans le groupe M2, le site greffé a été recouvert d'une membrane alternative en d-PTFE (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Aucun groupe témoin sans intervention n'a été inclus dans cette étude, car des études de recherche antérieures ont démontré que l'absence de préservation de l'alvéole entraîne une perte de volume significativement plus importante que lorsque des techniques de préservation sont appliquées.

Après extraction dentaire et curetage, l'intégrité de la paroi osseuse buccale sera évaluée. Ensuite, la base et la partie centrale de l'alvéole seront remplies d'os autologue, tandis que la partie supérieure restante (jusqu'au niveau de la paroi buccale) sera remplie d'un mélange 50/50 de biomatériau osseux bovin et d'os autologue. Une membrane d-PTFE sera positionnée sous les lambeaux de tissus mous buccaux et lingual, couvrant 3 à 5 mm de la paroi osseuse supérieure. La partie centrale de la membrane restera exposée, sans tentative de fermeture primaire de la plaie.

Cette approche permet une couverture membranaire sur mesure en fonction du degré de préservation de la paroi buccale, optimisant ainsi le soutien à la régénération osseuse. Avant la chirurgie, tous les participants ont subi une élimination mécanique de la plaque dentaire et du tartre et ont été formés aux pratiques d'hygiène bucco-dentaire. Un antibiotique oral Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Zagreb, Croatie, ou Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharma. Fabrik GmbH, Ingbert, Allemagne, pour les patients allergiques à la pénicilline, sera administré une heure avant la chirurgie. De plus, les patients se sont rincés avec une solution de digluconate de chlorhexidine à 0,2 % (Parodontax 0,2 %, Brentford, Londres, Royaume-Uni) en préopératoire.

2.4. Protocole chirurgical et extraction membranaire Suite au bilan préopératoire, une anesthésie locale à 4 % de chlorhydrate d'articaïne avec adrénaline à une concentration de 1 : 200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Allemagne) a été administrée dans deux régions : la zone indiquée pour l'extraction dentaire et la zone rétromolaire. région dans le même quadrant de la mâchoire, sélectionnée pour le prélèvement d'os autogène. Après extraction atraumatique de la dent, l'alvéole a été soigneusement débridée et l'intégrité des parois osseuses a été évaluée à l'aide d'une sonde parodontale (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Suite à une incision intrasulculaire autour de la surface buccale des dents adjacentes, un lambeau mucopériosté de pleine épaisseur a été surélevé à l'aide d'une curette chirurgicale (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Allemagne). Après une évaluation approfondie des parois osseuses buccales et de la quantité d'autogreffe requise, un lambeau de pleine épaisseur a été élevé au niveau du site donneur et l'os autogène a été prélevé à l'aide du grattoir à os Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Bâle, Suisse). . Le site donneur a ensuite été fermé avec intention primaire en utilisant des techniques de suture standard.

La greffe a été réalisée avec le mélange de xénogreffe bovine (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Allemagne) et d'autogreffe. Sur la base de l'affectation des groupes, une membrane d-PTFE a été utilisée pour recouvrir l'alvéole d'extraction - soit permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Allemagne) pour le groupe M1, soit Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) pour le groupe M2. Le lambeau a été repositionné et fixé avec des sutures monofilament résorbables 6.0 (SMI, St. Vith, Belgique, Surgicryl Rapid 6.0), laissant la partie centrale de la membrane intentionnellement exposée.

Quatre semaines après l'extraction, la membrane d-PTFE a été retirée dans les deux groupes, laissant le pseudopérioste recouvrant la partie crestale de l'alvéole d'extraction exposé pour favoriser la cicatrisation. La membrane a ensuite été préparée pour une analyse plus approfondie en laboratoire et la cicatrisation a pu progresser pendant six mois, après quoi la pose de l'implant a été réalisée dans le site préparé.

Pour évaluer l'adhérence bactérienne sur les membranes d-PTFE, des échantillons ont été préparés pour une analyse SEM immédiatement après le retrait de la membrane après 4 semaines de cicatrisation. Après une incubation de 4 heures dans des suspensions bactériennes, les membranes ont été rincées dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS), puis séchées à l'air dans une chambre stérile à haut débit. Les membranes ont ensuite été fixées à 4°C avec une solution contenant 4 % de glutar-aldéhyde et 0,5 % de paraformaldéhyde (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) dans du PBS 0,1 M (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA). ). Après fixation, les échantillons ont subi un processus de déshydratation progressive par immersion dans des concentrations croissantes d'éthanol (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %) pour se préparer à l'imagerie. Chaque membrane a ensuite été montée sur un porte-échantillon à l'aide d'un ruban de carbone conducteur. Pour améliorer la conductivité de surface et empêcher la charge des électrons dans les conditions de vide poussé du faisceau d'électrons, une fine couche d'or-palladium de 15 nm a été appliquée à l'aide du système de gravure et de revêtement de précision (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Californie, États-Unis). ). Enfin, l'imagerie SEM a été réalisée avec un microscope électronique à balayage à émission de champ Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokyo, Japon), en utilisant une tension accélératrice de 7 kV et une distance de travail de 10 mm. Cette approche a permis une visualisation haute résolution de la morphologie du biofilm et de la distribution bactérienne sur les surfaces membranaires.

Extraction des acides nucléiques de l'ADN L'ADN a été isolé à partir d'échantillons de membrane soniquée collectés à l'aide du kit Nucleospin Tissue (Macherey Nagel, Duren, Allemagne) en suivant un protocole bactérien modifié. Les échantillons soniqués dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml ont été centrifugés à 15 000 tr/min pendant 15 minutes, après quoi le surnageant a été éliminé, laissant environ 50 µl de sédiment. Ce sédiment a été remis en suspension dans 250 µl d'un tampon de lyse G+ préparé, comme spécifié par le protocole bactérien modifié du fabricant, et soigneusement vortexé. Ensuite, 40 µl de solution de lysozyme fraîchement préparée ont été ajoutés et l'échantillon a été incubé à 37 ° C pendant 1 heure. Ensuite, 30 µl de protéinase K ont été ajoutés et l'échantillon a été incubé à 56°C pendant 2 heures. Après incubation, 400 µl de tampon B3 ont été ajoutés, l'échantillon a été vortexé, puis incubé à nouveau à 70°C pendant 15 minutes. L'ADN a été précipité en ajoutant 400 µl d'éthanol à 98 % réfrigéré. Le protocole du fabricant a été repris pour les étapes suivantes, le volume d'élution final étant réduit à 50 µl de BE. La concentration et la pureté de l'ADN génomique extrait ont été évaluées à l'aide d'un fluoromètre Qubit.

Analyse PCR quantitative en temps réel (qPCR) La quantification des bactéries dans les échantillons de sonication membranaire a été réalisée par RT-PCR sur un système de PCR rapide en temps réel Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis), avec des tests TaqMan spécifiques. (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) ciblant des espèces bactériennes clés. Ces analyses incluaient des bactéries cariogènes significatives, telles que les anaérobies facultatifs à Gram positif Streptococcus mutans et Streptococcus sobrinus, connus pour leur contribution à haut risque au développement des caries, et Streptococcus salivarius, qui agit comme un antagoniste de ces espèces. De plus, les anaérobies Gram négatifs Veillonella parvula et Aggregatibacter actinomycetemcomitans ont été analysés pour explorer les interactions et les associations de biofilms avec la progression des infections gingivales et parodontales. Un test TaqMan spécifique pour le gène de l'ARNr 16s a été utilisé pour représenter la charge bactérienne totale dans la plaque dentaire. Les amorces et les sondes du test TaqMan ont été conçues pour cibler spécifiquement les gènes de chaque bactérie. Pour la quantification bactérienne totale, la région conservée du gène de l'ARNr 16s a été sélectionnée comme référence.

Le mélange réactionnel RT-PCR (20 µL) était constitué de 10 µL de TaqMan Master Mix, 1 µL de tests TaqMan personnalisés individuels pour chaque bactérie sélectionnée, 4 µL d’eau et 5 µL d’échantillon d’ADN dilué à 0,5 ng/µL. Chaque test TaqMan contenait des amorces spécifiques conçues sur mesure pour amplifier les gènes gtfB, gtfT, tnpA, lktA et rpoB, ainsi que le gène de l'ARNr 16s comme contrôle de référence. De plus, chaque test comprenait une sonde TaqMan marquée par fluorescence conçue sur mesure avec un colorant AM (fluorescéine amidite) et un Q (extincteur). Les conditions de PCR sur le système 7500 Fast Real-Time PCR étaient les suivantes : une incubation initiale à 95°C pendant 10 minutes pour l'activation de l'ADN polymérase Taq, suivie de 50 cycles à 95°C pendant 15 secondes (dénaturation de l'ADN) et 60°C. C pendant 1 minute (liaison et extension de l'amorce). Les réactions ont été réalisées dans des plaques à 96 puits avec des triples pour chaque bactérie, ainsi que des contrôles sans modèle pour tous les gènes.

La détection et la quantification des gènes amplifiés pour chaque espèce bactérienne et de l'ARNr 16s total étaient basées sur les modifications du signal de fluorescence des sondes TaqMan. La fluorescence était émise lors de l'hybridation et de l'hydrolyse de la sonde au niveau du site d'acide nucléique cible, de sorte qu'une augmentation de l'intensité de la fluorescence indiquait le niveau d'amplification du gène. Les résultats ont été mesurés à l’aide d’une valeur de cycle seuil (Ct), qui représente le niveau de fluorescence nécessaire à la détection et est systématiquement définie dans la phase d’amplification exponentielle. Lorsqu'une quantité suffisante d'ADN du gène cible est amplifiée, le signal fluorescent est détecté, la valeur Ct indiquant le cycle au cours duquel la détection a eu lieu. Une valeur Ct plus élevée correspond à une concentration initiale plus faible du gène cible dans l’échantillon, tandis qu’une valeur Ct plus faible indique une concentration initiale plus élevée.

La quantification relative de chaque population bactérienne a été calculée à l'aide de ΔCt, représentant la différence entre la valeur Ct pour le groupe bactérien cible et la valeur Ct pour la charge bactérienne totale (équivalent ARNr 16s).

NGS Aux fins du séquençage des amplicons des régions variables 3 et 4 du gène de l'ARNr 16S, l'ADN a été isolé des échantillons de membranes 20 M1 et 16 M2 et envoyé au laboratoire de recherche moléculaire (MRDNA) au Texas, aux États-Unis. Le séquençage des amplicons a utilisé un ensemble d'amorces 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') et 806R (5'-GGACTACNNGGTATCTAAT-3'). Les données de séquençage ont été téléchargées à partir du « BaseSpace Sequence Hub d’Illumina » sous la forme de fichiers fastq démultiplexés à extrémités appariées. Le traitement des données a été effectué à l'aide du progiciel Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Le traitement comprenait le filtrage et le débruitage à l'aide du programme DADA2, la concaténation de séquences (puisque le séquençage en bout de paire était utilisé), ainsi que le contrôle de la présence d'éventuelles chimères. Pour la détermination taxonomique des micro-organismes, l'outil de classification Naive Bayes de QIIME2 a été appliqué, adapté pour fonctionner avec la base de données SILVA, version 138. Les séquences ont été regroupées selon le critère de similarité de 99%.

La diversité et la richesse de tous les échantillons ont été estimées par la diversité alpha (indice de Shannon) et la diversité bêta (dissimilitude de Bray-Curtis) à l'aide des bibliothèques seaborn, matplotlib, pandas et matplotlib par le langage de programmation Python, version 3.12, dans l'environnement Pycharm.