Microbioomanalyse van tandheelkundige biofilm op polytetrafluorethyleenmembranen met hoge dichtheid die worden gebruikt bij het conserveren van sockets (MADBioS)

Deze studie werd georganiseerd als een gerandomiseerde, gecontroleerde klinische studie, waarbij patiënten werden gerecruteerd uit een algemene populatie van kaakchirurgische praktijken. De deelnemer is geïndiceerd voor ten minste één tandextractie en daaropvolgende plaatsing van een implantaat, omdat conventionele therapieën er niet in slagen de aangetaste tanden te behouden. Voordat ze aan het onderzoek deelnemen, moeten alle deelnemers geïnformeerde toestemming geven nadat ze de onderzoeksgegevens hebben bekeken.

Van de 56 aanvankelijk gescreende deelnemers voldeden 39 deelnemers aan de inclusiecriteria en werden willekeurig toegewezen aan een van de twee studiegroepen via een webgebaseerde randomisatietool (https://www.randomizer.org/). In beide groepen zal onmiddellijk na de tandextractie een sockettransplantatieprocedure worden uitgevoerd, met behulp van een samengesteld bottransplantaat bestaande uit 50% autogeen bot en 50% runderxenotransplantaat (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Duitsland), nadat de deelnemers willekeurig waren toegewezen aan de volgende groepen:

• M1: In de groep M1 was de getransplanteerde plaats bedekt met een d-PTFE-membraan (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Duitsland), en
• M2: In de groep M2 was de getransplanteerde plaats bedekt met een alternatief d-PTFE-membraan (Cytoplast ™, Osteogenics Biomedical, Texas, VS).

In dit onderzoek is geen niet-interventiecontrolegroep opgenomen, omdat eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat de afwezigheid van socketconservering tot een aanzienlijk groter volumeverlies leidt in vergelijking met wanneer conserveringstechnieken worden toegepast.

Na tandextractie en curettage wordt de integriteit van de buccale botwand beoordeeld. Vervolgens worden het basis- en centrale gedeelte van de holte gevuld met autoloog bot, terwijl het resterende bovenste gedeelte (tot het niveau van de buccale wand) wordt gevuld met een 50:50 mengsel van biomateriaal van runderbot en autoloog bot. Onder de buccale en linguale flappen van zacht weefsel wordt een d-PTFE-membraan geplaatst, dat 3-5 mm van de bovenste botwand bedekt. Het centrale deel van het membraan zal bloot blijven, zonder enige poging om primaire wondsluiting te bewerkstelligen.

Deze aanpak maakt membraandekking op maat mogelijk op basis van de mate van behoud van de mondwand, waardoor de ondersteuning voor botregeneratie wordt geoptimaliseerd. Voorafgaand aan de operatie kregen alle deelnemers mechanische tandplak- en tandsteenverwijdering en kregen ze instructies over mondhygiënepraktijken. Een oraal antibioticum Klavocin bod 1000 mg, Pliva, Zagreb, Kroatië, of Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Farm. Fabrik GmbH, Ingbert, Duitsland, voor penicilline-allergische patiënten, zal één uur vóór de operatie worden toegediend. Bovendien spoelden patiënten preoperatief met een 0,2% chloorhexidinedigluconaatoplossing (Parodontax 0,2%, Brentford, Londen, VK).

2.4. Chirurgisch protocol en membraanextractie Na de preoperatieve beoordeling werd lokale anesthesie 4% articaïnehydrochloride met adrenaline in een concentratie van 1:200.000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Duitsland) toegediend aan twee regio's: het gebied dat is geïndiceerd voor tandextractie en de retromolaar. regio in hetzelfde kaakkwadrant, geselecteerd voor autogene botoogst. Na atraumatische extractie van de tand werd de koker grondig gedebrideerd en werd de integriteit van de botwanden beoordeeld met een parodontale sonde (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, VS). Na een intrasulculaire incisie rond het buccale oppervlak van de aangrenzende tanden werd een mucoperiosteale flap over de volledige dikte omhoog gebracht met behulp van een chirurgische curette (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Duitsland). Na een grondige beoordeling van de buccale botwanden en de vereiste hoeveelheid autotransplantaat, werd een flap van volledige dikte op de donorplaats opgetrokken en werd autogeen bot geoogst met behulp van de Safescraper® Twist-botschraper (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Bazel, Zwitserland). . De donorplaats werd vervolgens met primaire bedoeling gesloten met behulp van standaard hechttechnieken.

Het enten werd uitgevoerd met het mengsel van runderxenotransplantaat (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Duitsland) en autotransplantaat. Op basis van groepstoewijzing werd een d-PTFE-membraan gebruikt om de extractiekoker af te dekken - ofwel permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Duitsland) voor de M1-groep of Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, VS) voor de M2-groep. De flap werd opnieuw gepositioneerd en vastgezet met resorbeerbare monofilament 6.0-hechtingen (SMI, St. Vith, België, Surgicryl Rapid 6.0), waarbij het centrale deel van het membraan opzettelijk bloot bleef.

Vier weken na de extractie werd het d-PTFE-membraan in beide groepen verwijderd, waardoor het pseudoperiosteum dat het crestale deel van de extractiekoker bedekte, bloot bleef om de genezing te ondersteunen. Het membraan werd vervolgens voorbereid voor verdere laboratoriumanalyse en de genezing liet zich gedurende zes maanden voortzetten, waarna plaatsing van het implantaat op de voorbereide plaats werd uitgevoerd.

Om de bacteriële hechting op de d-PTFE-membranen te evalueren, werden monsters onmiddellijk na verwijdering van het membraan na 4 weken genezing voorbereid voor SEM-analyse. Na incubatie in bacteriële suspensies gedurende 4 uur werden de membranen gespoeld in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en vervolgens aan de lucht gedroogd in een steriele kamer met hoge stroomsnelheid. Membranen werden vervolgens bij 4 ° C gefixeerd met een oplossing die 4% glutaaraldehyde en 0,5% paraformaldehyde bevatte (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, VS) in 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, VS). ). Na fixatie ondergingen de monsters een geleidelijk dehydratatieproces door onderdompeling in toenemende ethanolconcentraties (50%, 70%, 80%, 90% en 100%) ter voorbereiding op beeldvorming. Elk membraan werd vervolgens op een monsterhouder gemonteerd met behulp van geleidende koolstoftape. Om de geleidbaarheid van het oppervlak te verbeteren en het opladen van elektronen onder de hoogvacuümomstandigheden van de elektronenbundel te voorkomen, werd een dunne laag goud-palladium van 15 nm aangebracht met behulp van het precisie-ets- en coatingsysteem (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Californië, VS). ). Ten slotte werd SEM-beeldvorming uitgevoerd met een Jeol JSM-7800F veldemissie-scanning-elektronenmicroscoop (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), met behulp van een versnellingsspanning van 7 kV en een werkafstand van 10 mm. Deze aanpak maakte visualisatie met hoge resolutie van de biofilmmorfologie en bacteriële distributie op de membraanoppervlakken mogelijk.

Extractie van DNA-nucleïnezuren DNA werd geïsoleerd uit verzamelde membraansonicatiemonsters met behulp van de Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Duitsland) volgens een gemodificeerd bacterieel protocol. Gesoniceerde monsters in Eppendorf-buisjes van 1,5 ml werden 15 minuten bij 15.000 rpm gecentrifugeerd, waarna het supernatant werd verwijderd, waardoor ongeveer 50 μl sediment achterbleef. Dit sediment werd opnieuw gesuspendeerd in 250 μl van een bereide G+-lysebuffer, zoals gespecificeerd door het gemodificeerde bacteriële protocol van de fabrikant, en grondig gewerveld. Vervolgens werd 40 μl vers bereide lysozymoplossing toegevoegd en het monster werd gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd. Hierna werd 30 μl proteïnase K toegevoegd en het monster werd gedurende 2 uur bij 56°C geïncubeerd. Na incubatie werd 400 μl B3-buffer toegevoegd, het monster werd gewerveld en vervolgens opnieuw gedurende 15 minuten bij 70°C geïncubeerd. DNA werd geprecipiteerd door toevoeging van 400 μl gekoelde 98% ethanol. Het protocol van de fabrikant werd hervat voor de volgende stappen, waarbij het uiteindelijke elutievolume werd teruggebracht tot 50 μl BE. De concentratie en zuiverheid van het geëxtraheerde genomische DNA werden beoordeeld met behulp van een Qubit-fluorometer.

Kwantitatieve Real-Time PCR (qPCR) analyse Kwantificering van bacteriën in de ultrasone membraanmonsters werd uitgevoerd met behulp van RT-PCR op een Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Californië, VS), met specifieke TaqMan-testen (Applied Biosystems, Foster City, Californië, VS) gericht op belangrijke bacteriesoorten. Deze testen omvatten bacteriën van cariogene betekenis, zoals de grampositieve facultatieve anaëroben Streptococcus mutans en Streptococcus sobrinus, bekend om hun risicovolle bijdrage aan de ontwikkeling van cariës, en Streptococcus salivarius, die als antagonist tegen deze soorten werkt. Daarnaast werden de gramnegatieve anaëroben Veillonella parvula en Aggregatibacter actinomycetemcomitans geanalyseerd om biofilminteracties en associaties met de progressie van gingivale en parodontale infecties te onderzoeken. Een specifieke TaqMan-test voor het 16s-rRNA-gen werd gebruikt om de totale bacteriële belasting in tandplak weer te geven. TaqMan-testprimers en -probes zijn ontworpen om specifiek op de genen van elke bacterie te richten. Voor totale bacteriële kwantificering werd het geconserveerde gebied van het 16s-rRNA-gen als referentie geselecteerd.

Het RT-PCR-reactiemengsel (20 µl) bestond uit 10 µl TaqMan Master Mix, 1 µl individuele aangepaste TaqMan-testen voor elke geselecteerde bacterie, 4 µl water en 5 µl DNA-monster verdund tot 0,5 ng/μl. Elke TaqMan-test bevatte specifieke, op maat ontworpen primers voor het amplificeren van de gtfB-, gtfT-, tnpA-, lktA- en rpoB-genen, evenals het 16s-rRNA-gen als referentiecontrole. Bovendien bevatte elke test een op maat ontworpen TaqMan fluorescent gelabelde probe met AM (fluoresceïne amidiet) kleurstof en een Q (quencher). De PCR-omstandigheden op het 7500 Fast Real-Time PCR-systeem waren als volgt: een initiële incubatie bij 95°C gedurende 10 minuten voor Taq DNA-polymerase-activering, gevolgd door 50 cycli van 95°C gedurende 15 seconden (DNA-denaturatie) en 60°C. C gedurende 1 minuut (primerbinding en verlenging). De reacties werden uitgevoerd in platen met 96 putjes met triplo's voor elke bacterie, naast niet-sjablooncontroles voor alle genen.

Detectie en kwantificering van de geamplificeerde genen voor elke bacteriesoort en het totale 16s-rRNA waren gebaseerd op veranderingen in het fluorescentiesignaal van de TaqMan-sondes. Fluorescentie werd uitgezonden bij hybridisatie en hydrolyse van de probe op de doelnucleïnezuurplaats, dus een toename in fluorescentie-intensiteit gaf het niveau van genamplificatie aan. De resultaten werden gemeten met behulp van een drempelcycluswaarde (Ct), die het fluorescentieniveau vertegenwoordigt dat nodig is voor detectie en die consistent wordt ingesteld binnen de exponentiële amplificatiefase. Als er voldoende DNA van het doelgen is geamplificeerd, wordt het fluorescentiesignaal gedetecteerd, waarbij de Ct-waarde de cyclus aangeeft waarin detectie plaatsvond. Een hogere Ct-waarde komt overeen met een lagere initiële concentratie van het doelgen in het monster, terwijl een lagere Ct-waarde een hogere initiële concentratie aangeeft.

De relatieve kwantificering van elke bacteriepopulatie werd berekend met behulp van ΔCt, wat het verschil vertegenwoordigt tussen de Ct-waarde voor de doelbacteriegroep en de Ct-waarde voor de totale bacteriële belasting (16s rRNA-equivalent).

NGS Voor ampliconsequencing van variabele gebieden 3 en 4 van het 16S rRNA-gen werd DNA geïsoleerd uit de monsters van 20 M1- en 16 M2-membranen en naar het Molecular Research Laboratory (MRDNA) in Texas, VS gestuurd. Amplicon-sequencing maakte gebruik van een set primers 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') en 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Sequentiegegevens werden gedownload van "Illumina's BaseSpace Sequence Hub" in de vorm van gepaarde, gedemultiplexte fastq-bestanden. De gegevensverwerking werd uitgevoerd met behulp van het softwarepakket Quantitative Insights Into Mbiotic Ecology 2 (QIIME2). De verwerking omvatte het filteren en het verwijderen van ruis met behulp van het DADA2-programma, het aaneenschakelen van sequenties (aangezien pair-end sequencing werd gebruikt), evenals de controle op de aanwezigheid van mogelijke chimaera's. Voor de taxonomische bepaling van micro-organismen werd de Naive Bayes-classificatietool in QIIME2 toegepast, aangepast om te werken met de SILVA-database, versie 138. De sequenties werden gegroepeerd volgens het criterium van 99% gelijkenis.

De diversiteit en rijkdom van alle monsters werd geschat op basis van alfadiversiteit (Shannon-index) en bètadiversiteit (Bray-Curtis-ongelijkheid) met behulp van de seaborn-, matplotlib-, pandas- en matplotlib-bibliotheken door de programmeertaal Python, versie 3.12, binnen de Pycharm-omgeving.