Mikrobiomová analýza dentálního biofilmu na polytetrafluorethylenových membránách s vysokou hustotou používaných při konzervaci zásuvek (MADBioS)

Tato studie byla organizována jako randomizovaná kontrolovaná klinická studie, která zahrnovala pacienty z běžné populace v ordinaci ústní chirurgie. Účastníci jsou indikováni k minimálně jedné extrakci zubu a následnému zavedení implantátu z důvodu selhání konvenčních terapií k zachování postižených zubů. Před vstupem do studie musí všichni účastníci po přezkoumání podrobností studie poskytnout informovaný souhlas.

Z 56 účastníků původně screenovaných 39 účastníků splnilo kritéria pro zařazení a byli náhodně rozděleni do jedné ze dvou studijních skupin pomocí webového randomizačního nástroje (https://www.randomizer.org/). V obou skupinách bude ihned po extrakci zubu proveden štěp zásuvkového štěpu s použitím kompozitního kostního štěpu obsahujícího 50 % autogenní kosti a 50 % bovinního xenograftu (cerabone®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Německo), poté, co byli účastníci náhodně rozděleni do následujících skupin:

• M1: Ve skupině M1 bylo místo štěpu pokryto membránou d-PTFE (Permamem®, botiss biomaterials GmbH, Zossen, Německo) a
• M2: Ve skupině M2 bylo místo štěpu pokryto alternativní membránou d-PTFE (Cytoplast™, Osteogenics Biomedical, Texas, USA).

Do této studie nebyla zahrnuta žádná neintervenční kontrolní skupina, protože předchozí výzkumné studie prokázaly, že absence konzervace zásuvky vede k významně větší objemové ztrátě ve srovnání s aplikací konzervačních technik.

Po extrakci zubu a kyretáži bude posouzena integrita stěny bukální kosti. Poté bude základna a centrální část jamky vyplněna autologní kostí, zatímco zbývající horní část (až do úrovně bukální stěny) bude vyplněna směsí biomateriálu hovězí kosti a autologní kosti v poměru 50:50. Membrána d-PTFE bude umístěna pod bukální a lingvální chlopně měkkých tkání, pokrývající 3-5 mm horní kostní stěny. Centrální část membrány zůstane obnažena, bez pokusu o dosažení primárního uzavření rány.

Tento přístup umožňuje přizpůsobené pokrytí membrány na základě stupně zachování bukální stěny a optimalizuje podporu pro regeneraci kosti. Před operací byli všichni účastníci mechanicky odstraněni plaku a zubního kamene a byli poučeni o postupech ústní hygieny. Perorální antibiotikum Klavocin bid 1000 mg, Pliva, Záhřeb, Chorvatsko, nebo Clindamycin MIP 600 mg, Chem. Pharm. Fabrik GmbH, Ingbert, Německo, pro pacienty s alergií na penicilin, bude podán jednu hodinu před operací. Navíc byli pacienti předoperačně opláchnuti 0,2% roztokem chlorhexidin diglukonátu (Parodontax 0,2%, Brentford, Londýn, Velká Británie).

2.4. Operační protokol a extrakce membrány Po předoperačním posouzení byla lokální anestezie 4% articain hydrochlorid s adrenalinem v koncentraci 1:200 000 (Ubistesin Forte, 3M, Neuss, Německo) podána do dvou oblastí: oblasti indikované k extrakci zubu a retromoláru oblasti ve stejném kvadrantu čelisti, vybrané pro autogenní odběr kosti. Po atraumatické extrakci zubu byla jamka důkladně vyčištěna a integrita kostních stěn byla posouzena parodontální sondou (15 UNC Color-Coded, Hu-Friedy, Chicago, USA). Po intrasulkulární incizi kolem bukálního povrchu sousedních zubů byl pomocí chirurgické kyrety zvýšen mukoperiostální lalok v plné tloušťce (Lucas 2,5 mm, Helmut Zepf, Seitingen-Oberflacht, Německo). Po důkladném posouzení stěn bukální kosti a požadovaného množství autoštěpu byla v místě dárce zvýšena chlopeň v plné tloušťce a pomocí kostní škrabky Safescraper® Twist (Geistlich Bone Harvesting Instruments, Basel, Švýcarsko) byla odebrána autogenní kost. . Dárcovské místo bylo následně s primárním záměrem uzavřeno pomocí standardních šicích technik.

Roubování bylo provedeno směsí bovinního xenograftu (cerabone®, Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Německo) a autoštěpu. Na základě skupinového přiřazení byla k zakrytí extrakčního hrdla použita membrána d-PTFE - buď permamem® (Botiss Biomaterials GmbH, Zossen, Německo) pro skupinu M1 nebo Cytoplast™ (Osteogenics Biomedical, Texas, USA) pro skupinu M2. Klapka byla přemístěna a zajištěna vstřebatelným monofilním stehem 6.0 (SMI, St. Vith, Belgie, Surgicryl Rapid 6.0), přičemž centrální část membrány byla záměrně obnažena.

Čtyři týdny po extrakci byla d-PTFE membrána odstraněna v obou skupinách, takže pseudoperiosteum pokrývající hřebenovou část extrakčního hrdla bylo vystaveno pro podporu hojení. Membrána byla poté připravena k dalšímu laboratornímu rozboru a hojení bylo ponecháno progredovat po dobu šesti měsíců, poté bylo provedeno umístění implantátu na připravené místo.

Pro vyhodnocení bakteriální adherence na d-PTFE membrány byly vzorky připraveny pro SEM analýzu ihned po odstranění membrány po 4 týdnech hojení. Po inkubaci v bakteriálních suspenzích po dobu 4 hodin byly membrány opláchnuty ve sterilním fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) a poté vysušeny na vzduchu ve sterilní komoře s vysokým průtokem. Membrány byly poté fixovány při 4 °C roztokem obsahujícím 4 % glutaraldehydu a 0,5 % paraformaldehydu (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA) v 0,1 M PBS (pH 7,2) (Sigma-Aldrich, Burlington, Vermont, USA ). Po fixaci byly vzorky podrobeny postupnému dehydratačnímu procesu ponořením do zvyšujících se koncentrací ethanolu (50 %, 70 %, 80 %, 90 % a 100 %) za účelem přípravy na zobrazení. Každá membrána byla poté namontována na držák vzorku pomocí vodivého uhlíkového pásku. Pro zvýšení povrchové vodivosti a zabránění nabíjení elektronů za podmínek vysokého vakua elektronového paprsku byla nanesena tenká 15 nm vrstva zlata-palladia pomocí systému přesného leptání a povlakování (PECS II, Gatan Inc., Pleasanton, Kalifornie, USA ). Nakonec bylo SEM zobrazování provedeno pomocí skenovacího elektronového mikroskopu Jeol JSM-7800F (JEOL Ltd., Tokio, Japonsko) s použitím urychlovacího napětí 7 kV a pracovní vzdálenosti 10 mm. Tento přístup umožnil vizualizaci morfologie biofilmu a distribuce bakterií na površích membrán ve vysokém rozlišení.

Extrakce DNA nukleových kyselin DNA byla izolována z odebraných vzorků membránového sonikátu pomocí Nucleospin Tissue Kit (Macherey Nagel, Duren, Německo) podle modifikovaného bakteriálního protokolu. Sonikované vzorky v 1,5 ml Eppendorfových zkumavkách byly odstřeďovány při 15 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, poté byl supernatant odstraněn a zůstalo přibližně 50 μl sedimentu. Tento sediment byl resuspendován ve 250 μl připraveného G+ lyzačního pufru, jak je uvedeno v modifikovaném bakteriálním protokolu výrobce, a důkladně promíchán. Dále bylo přidáno 40 μl čerstvě připraveného roztoku lysozymu a vzorek byl inkubován při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté bylo přidáno 30 ul proteinázy K a vzorek byl inkubován při 56 °C po dobu 2 hodin. Po inkubaci bylo přidáno 400 ul B3 pufru, vzorek byl promíchán na vortexu a poté znovu inkubován při 70 °C po dobu 15 minut. DNA byla vysrážena přidáním 400 μl vychlazeného 98% ethanolu. Pro následné kroky byl obnoven protokol výrobce, přičemž konečný eluční objem byl snížen na 50 μl BE. Koncentrace a čistota extrahované genomové DNA byly hodnoceny pomocí Qubit fluorometru.

Kvantitativní analýza PCR v reálném čase (qPCR) Kvantitativní analýza bakterií ve vzorcích membránového ultrazvuku byla provedena pomocí RT-PCR na systému Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA), se specifickými testy TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornie, USA) zaměřené na klíčové bakteriální druhy. Tyto testy zahrnovaly bakterie kariogenního významu, jako jsou grampozitivní fakultativní anaeroby Streptococcus mutans a Streptococcus sobrinus, známé svým vysoce rizikovým podílem na rozvoji zubního kazu, a Streptococcus salivarius, který působí jako antagonista těchto druhů. Kromě toho byly analyzovány gramnegativní anaeroby Veillonella parvula a Aggregatibacter aktinomycetemcomitans, aby se prozkoumaly interakce biofilmu a asociace s progresí gingivální a periodontální infekce. Pro reprezentaci celkové bakteriální zátěže v zubním plaku byl použit specifický TaqMan test pro gen 16s rRNA. TaqMan testovací primery a sondy byly navrženy tak, aby specificky cílily geny pro každou bakterii. Pro celkovou bakteriální kvantifikaci byla jako referenční vybrána konzervovaná oblast genu 16s rRNA.

Reakční směs RT-PCR (20 ul) se skládala z 10 ul TaqMan Master Mix, 1 ul individuálních Custom TaqMan testů pro každou vybranou bakterii, 4 ul vody a 5 ul vzorku DNA zředěného na 0,5 ng/ul. Každý test TaqMan obsahoval specifické na zakázku navržené primery pro amplifikaci genů gtfB, gtfT, tnpA, lktA a rpoB a také gen 16s rRNA jako referenční kontrolu. Navíc každý test zahrnoval na zakázku navrženou TaqMan fluorescenčně značenou sondu s AM (fluorescein amidit) barvivem a Q (zhášeč). Podmínky PCR na systému 7500 Fast Real-Time PCR byly následující: počáteční inkubace při 95 °C po dobu 10 minut pro aktivaci Taq DNA polymerázy, následovaná 50 cykly při 95 °C po dobu 15 sekund (denaturace DNA) a 60 ° C po dobu 1 minuty (primární vazba a prodloužení). Reakce byly prováděny v 96jamkových destičkách s triplikáty pro každou bakterii, spolu s kontrolami bez šablony pro všechny geny.

Detekce a kvantifikace amplifikovaných genů pro každý bakteriální druh a celková 16s rRNA byla založena na změnách fluorescenčního signálu sond TaqMan. Fluorescence byla emitována po hybridizaci a hydrolýze sondy v cílovém místě nukleové kyseliny, takže zvýšení intenzity fluorescence indikovalo úroveň amplifikace genu. Výsledky byly měřeny pomocí hodnoty prahového cyklu (Ct), která představuje úroveň fluorescence potřebnou pro detekci a je konzistentně nastavena v rámci exponenciální amplifikační fáze. Když je amplifikováno dostatečné množství DNA cílového genu, je detekován fluorescenční signál, přičemž hodnota Ct indikuje cyklus, ve kterém došlo k detekci. Vyšší hodnota Ct odpovídá nižší počáteční koncentraci cílového genu ve vzorku, zatímco nižší hodnota Ct indikuje vyšší počáteční koncentraci.

Relativní kvantifikace každé bakteriální populace byla vypočtena pomocí ACt, představující rozdíl mezi hodnotou Ct pro cílovou bakteriální skupinu a hodnotou Ct pro celkovou bakteriální zátěž (ekvivalent 16s rRNA).

NGS Pro účely amplikonového sekvenování variabilních oblastí 3 a 4 genu 16S rRNA byla DNA izolována ze vzorků 20 M1 a 16 M2 membrán a odeslána do Molecular Research Laboratory (MRDNA) v Texasu, USA. Sekvenování amplikonu použilo sadu primerů 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') a 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'). Sekvenační data byla stažena z "Illumina's BaseSpace Sequence Hub" ve formě párovaných, demultiplexovaných fastq souborů. Zpracování dat bylo provedeno pomocí softwarového balíku Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2). Zpracování zahrnovalo filtrování a odšumování pomocí programu DADA2, zřetězení sekvencí (protože bylo použito sekvenování na konci páru) a také kontrolu přítomnosti možných chimér. Pro taxonomické stanovení mikroorganismů byl použit klasifikátorový nástroj Naive Bayes v QIIME2, upravený pro práci s databází SILVA, verze 138. Sekvence byly seskupeny podle kritéria 99% podobnosti.

Diverzita a bohatost všech vzorků byla odhadnuta pomocí alfa diverzity (Shannon index) a beta diverzity (Bray-Curtis disimilarita) pomocí knihoven seaborn, matplotlib, pandas a matplotlib programovacím jazykem Python, verze 3.12, v prostředí Pycharm.